于天飛，謝鵬宇，孫婉姝，李 靜，尹海暢，黎 明，于志丹

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾大學 計算機與控制工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鵝細小病毒(Gooseparvovirus，GPV)是在雛鵝和雛番鴨中引起，以厭食、腹瀉和生長遲緩為典型癥狀的鵝細小病毒感染。該病發(fā)病率和死亡率高，一周齡內雛鵝感染GPV后死亡率可高達100%[1]。根據(jù)最新的ICTV病毒分類，GPV屬于細小病毒科依賴病毒屬，并與其親緣關系密切的番鴨細小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)[2]被列為單一種，即雁形目依賴細小病毒1[3]。1956年，我國學者方定一首次報道在江蘇省揚州地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種能使大批雛鵝死亡的未知傳染病，并于1961年用鵝胚分離到一種新病毒，他建議將該病毒定名為小鵝瘟病毒[4]。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)該病毒為細小病毒，因此命名為GPV。GPV的發(fā)現(xiàn)被視為我國動物醫(yī)學界的巨大成就之一。1978年世界家禽協(xié)會(World Poultry Association，WPA)建議把該病稱為鵝細小病毒感染。目前，世界上許多國家和地區(qū)都有該病的發(fā)生[5-7]。我國已經有22個省(自治區(qū)、直轄市)有該病流行和發(fā)生的報道[8-12]。近年來GPV與其他水禽病毒共感染情況日趨普遍，帶來的經濟損失巨大，嚴重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[13-17]。GPV為單鏈DNA病毒，基因組包含2 個開放閱讀框(ORF)，左側ORF編碼非結構蛋白NS，可編碼NS1以及NS2蛋白；右側ORF編碼結構蛋白VP，可編碼VP1、VP2 和VP3 3個結構蛋白，基因組兩端為末端倒置重復序列(ITR)[18]。單克隆抗體自發(fā)明以來極大地推動了現(xiàn)代生命科學的發(fā)展，其在病毒學研究領域應用廣泛[19]。盡管傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術已然成熟，但其制備過程費時費力，越來越不能滿足當前實踐中對動物疫病診斷快速簡便的要求[20]。抗體工程的出現(xiàn)和快速發(fā)展使人們有能力克服傳統(tǒng)方法的缺點，通過改造抗體揚長避短，擴展了抗體應用的領域。如通過基因工程的方法克隆出雜交瘤細胞株中抗體基因的可變區(qū)序列，獲得特定單抗的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)序列，構建入真核、原核表達載體中，就可以表達和制備有活性的重組抗體蛋白，這樣不僅可以避免因雜交瘤細胞系易丟失染色體而失去應用價值、降低檢測成本，還為抗體的定點基因改造進而提高親和力打下了基礎[21]。本研究通過原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)抗 GPV NS1蛋白單克隆抗體VL、VH基因的表達，通過間接ELISA方法探究重組蛋白與GPV NS1蛋白的結合活性，制備可與GPV非結構蛋白特異性結合的基因工程抗體蛋白，為GPV檢測奠定一定的物質基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、質粒、蛋白和抗體 原核表達載體pET-32a、大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)、GPV感染鵝血清(瓊擴試驗效價1∶16)和重組GST-NS1蛋白(0.48 mg/mL)由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學實驗室保存。辣根過氧化物酶(HRP)標記His標簽單克隆抗體購自Thermo Fisher公司；HRP標記兔抗鵝IgG由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學實驗室制備保存。

1.1.2 主要試劑 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA Marker、T4DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶購自TaKaRa公司。4氯-1-奈酚(4-CN)購自哈爾濱超峰生物科技發(fā)展有限公司。質粒提取試劑、膠回收試劑盒購自上海近岸科技有限公司。蛋白預染Marker購自Thermo Fisher公司。TMB顯色液、TMB顯色終止液購自上海碧云天生物技術有限公司。其余常規(guī)試劑為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達載體構建 參考單克隆抗體雜交瘤細胞株3D9分泌的抗GPV-NS1蛋白單克隆抗體(IgM型，輕鏈為κ鏈)的VL、VH基因序列[22]，依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子進行優(yōu)化后，交由蘇州金唯智生物股份有限公司合成，合成質粒命名為pUC57-VL和pUC57-VH。合成基因的兩端預留BamH Ⅰ和XhoⅠ限制性核酸內切酶酶切位點。用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pUC57-VL和pUC57-VH，回收目的片段VL和VH。將目的片段與同樣雙酶切回收后的表達載體pET-32a連接，轉化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL的固體LB平板，37 ℃培養(yǎng)14～16 h。挑取單菌落接種至含有Amp 100 μg/mL的液體LB中，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，提取質粒。單、雙酶切鑒定質粒，交由哈爾濱博仕生物科技有限公司進行序列測定。重組質粒分別命名為pET-VL和pET-VH。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-VL和pET-VH分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)，涂布含有Amp 100 μg/mL的固體LB平板。37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取單菌落，獲得重組菌株。重組菌接種于含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～14 h。以1%比例轉接新鮮的含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h后，菌液OD600達0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，37 ℃誘導1～4 h后收獲菌液沉淀，SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白分別命名為TRX-VL和TRX-VH。

1.2.3 重組蛋白純化及鑒定 重組蛋白經SDS-PAGE電泳后，參照參考文獻[12]的方法切膠純化。采用Bradford檢測法分別對重組蛋白的含量進行測定[13]。純化的重組蛋白經SDS-PAGE后，轉印至硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，PBST洗3 遍，參照參考文獻[12]的方法采用HRP標記的His標簽單克隆抗體進行鑒定。

1.2.4 間接ELISA鑒定TRX-VL、TRX-VH與GST-NS1的結合活性 用0.4 μg的GST-NS1包被酶標板過夜，5% BSA封閉過夜。將重組蛋白TRX-VL和TRX-VH濃度調整為10 μg/mL，加入1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80稀釋的TRX-VL、TRX-VH蛋白100 μL，以TRX蛋白作為陰性對照、GPV感染鵝血清作為陽性對照，37 ℃孵育1.5 h。之后加入1∶10 000稀釋的HRP標記抗His蛋白單抗或HRP標記兔抗鵝IgG，37 ℃孵育1 h。每次孵育間隔均洗滌3次。用TMB顯色，用酶標儀讀取OD450值。

1.2.5 阻斷試驗 用0.4 μg的GST-NS1包被酶標板過夜，5% BSA封閉過夜。加入1∶10，1∶100，1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000稀釋的GPV感染鵝血清，37 ℃孵育1.5 h。將重組蛋白TRX-VH濃度調整為10 μg/mL，加入1∶2稀釋的TRX-VH蛋白100 μL，37 ℃孵育1.5 h。之后加入1∶10 000稀釋的HRP標記抗His蛋白單抗，37 ℃孵育1 h。每次孵育間隔均洗滌3 次。用TMB顯色，用酶標儀讀取OD450值。

2 結果與分析

2.1 重組質粒酶切鑒定

構建的重組質粒pET-VL和pET-VH分別采用BamHⅠ單酶切和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，pET-VL經BamHⅠ單酶切獲得了6 240 bp的DNA條帶，BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切獲得了5 900 bp的載體片段和大小為340 bp的目的條帶；pET-VH經BamHⅠ單酶切獲得了6 270 bp的DNA條帶，BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切獲得了5 900 bp的載體片段和大小為370 bp的目的條帶。上述酶切結果與預期一致。測序結果證明外源基因插入載體位置與閱讀框均正確。

2.2 重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的表達

將構建的重組質粒pET-VL和pET-VH分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)，經1.0 mmol/L IPTG誘導后1，2，3，4 h進行取樣，SDS-PAGE結果表明，獲得了重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的表達，分子量分別為30.3，31.4 ku，與預期相符(圖1，箭頭所示)。

2.3 重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的純化及鑒定

重組蛋白TRX-VL和TRX-VH切膠純化，經His標簽單克隆抗體鑒定的結果表明，所獲得的表達蛋白為重組目的蛋白(圖2)。采用Bradford檢測法對重組蛋白的含量進行測定，獲得重組蛋白TRX-VL和TRX-VH濃度分別為0.87，0.74 mg/mL。

2.4 間接ELISA鑒定TRX-VH、TRX-VL與GST-NS1的結合活性

間接ELISA鑒定結果表明，TRX-VH對GST-NS1蛋白的結合顯示出了蛋白濃度相關性，結合能力隨著TRX-VH濃度的降低而變弱，在TRX-VH為25 ng(1∶40)時仍顯示出對抗原的一定結合活性；TRX-VL在各包被量下均沒有表現(xiàn)出結合能力(圖3)。

2.5 阻斷試驗

阻斷試驗結果表明，用0.4 μg的GST-NS1包被后，1∶10、1∶100和1∶200稀釋的GPV感染鵝血清可完全阻斷TRX-VH與GST-NS1蛋白的結合。1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋的GPV感染鵝血清阻斷能力顯示出濃度相關性，阻斷能力隨著血清濃度的降低而變弱(圖4)。

3 討論

天然抗體活性依賴于其復雜的立體結構和某些化學修飾，因此，可通過原核表達天然抗體的小分子片段獲得抗體活性片段[23]。抗體的VH和VL共同組成抗原結合部位，抗體的特異性正是由這一部分決定。目前的基因工程重組抗體以構建VH和VL融合的單鏈抗體(Single-chain Fv，scFv)在原核生物中表達最為普遍[22]。有研究表明，VH片段在抗體與相應抗原的特異性結合過程起主要作用[24-25]。也有報道表明，單獨的VL也能夠與抗原結合[26]，甚至有單獨的可變區(qū)CDR3片段結合抗原的報道[27]。這些有活性的小分子抗體片段在臨床應用上具有多方面優(yōu)勢，是替代多、單克隆抗體最有前途的新型抗體。本研究通過對抗GPV NS1單克隆抗體的小分子抗體片段的研究顯示，重組TRX-VH蛋白可以與GST-NS1抗原結合，而TRX-VL無法與GST-NS1抗原結合。王銳[22]制備的抗GST-NS1蛋白單克隆抗體的scFv與GST-NS1重組蛋白的ELISA結合效價為1∶40，與本研究數(shù)值相當，表明VH承擔了scFv的主要結合作用。由于單獨的VL、VH片段不包含F(xiàn)c片段，不易與常規(guī)的酶標二抗結合，給表達的抗體小分子片段的活性檢測帶來不便，為克服這一困難，本研究利用表達的融合蛋白上的標簽蛋白作為檢測標記?？紤]到標簽蛋白有可能影響融合蛋白的活性，本研究以TRX標簽蛋白作為對照，試驗結果表明，TRX標簽蛋白不影響TRX-VH與GST-NS1的結合。本研究制備的具有活性的重組TRX-VH蛋白有望替代傳統(tǒng)的多、單克隆抗體，給GPV的相關研究奠定了一定的物質基礎。