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        抗鵝細小病毒NS1蛋白單克隆抗體可變區(qū)的原核表達

        2021-11-01 06:28:52于天飛謝鵬宇孫婉姝尹海暢于志丹
        華北農學報 2021年5期

        于天飛,謝鵬宇,孫婉姝,李 靜,尹海暢,黎 明,于志丹

        (1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006;3.齊齊哈爾大學 計算機與控制工程學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

        鵝細小病毒(Gooseparvovirus,GPV)是在雛鵝和雛番鴨中引起,以厭食、腹瀉和生長遲緩為典型癥狀的鵝細小病毒感染。該病發(fā)病率和死亡率高,一周齡內雛鵝感染GPV后死亡率可高達100%[1]。根據(jù)最新的ICTV病毒分類,GPV屬于細小病毒科依賴病毒屬,并與其親緣關系密切的番鴨細小病毒(Muscovyduckparvovirus,MDPV)[2]被列為單一種,即雁形目依賴細小病毒1[3]。1956年,我國學者方定一首次報道在江蘇省揚州地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種能使大批雛鵝死亡的未知傳染病,并于1961年用鵝胚分離到一種新病毒,他建議將該病毒定名為小鵝瘟病毒[4]。后來,研究人員發(fā)現(xiàn)該病毒為細小病毒,因此命名為GPV。GPV的發(fā)現(xiàn)被視為我國動物醫(yī)學界的巨大成就之一。1978年世界家禽協(xié)會(World Poultry Association,WPA)建議把該病稱為鵝細小病毒感染。目前,世界上許多國家和地區(qū)都有該病的發(fā)生[5-7]。我國已經有22個省(自治區(qū)、直轄市)有該病流行和發(fā)生的報道[8-12]。近年來GPV與其他水禽病毒共感染情況日趨普遍,帶來的經濟損失巨大,嚴重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[13-17]。GPV為單鏈DNA病毒,基因組包含2 個開放閱讀框(ORF),左側ORF編碼非結構蛋白NS,可編碼NS1以及NS2蛋白;右側ORF編碼結構蛋白VP,可編碼VP1、VP2 和VP3 3個結構蛋白,基因組兩端為末端倒置重復序列(ITR)[18]。單克隆抗體自發(fā)明以來極大地推動了現(xiàn)代生命科學的發(fā)展,其在病毒學研究領域應用廣泛[19]。盡管傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術已然成熟,但其制備過程費時費力,越來越不能滿足當前實踐中對動物疫病診斷快速簡便的要求[20]。抗體工程的出現(xiàn)和快速發(fā)展使人們有能力克服傳統(tǒng)方法的缺點,通過改造抗體揚長避短,擴展了抗體應用的領域。如通過基因工程的方法克隆出雜交瘤細胞株中抗體基因的可變區(qū)序列,獲得特定單抗的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)序列,構建入真核、原核表達載體中,就可以表達和制備有活性的重組抗體蛋白,這樣不僅可以避免因雜交瘤細胞系易丟失染色體而失去應用價值、降低檢測成本,還為抗體的定點基因改造進而提高親和力打下了基礎[21]。本研究通過原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)抗 GPV NS1蛋白單克隆抗體VL、VH基因的表達,通過間接ELISA方法探究重組蛋白與GPV NS1蛋白的結合活性,制備可與GPV非結構蛋白特異性結合的基因工程抗體蛋白,為GPV檢測奠定一定的物質基礎。

        1 材料和方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌種、質粒、蛋白和抗體 原核表達載體pET-32a、大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)、GPV感染鵝血清(瓊擴試驗效價1∶16)和重組GST-NS1蛋白(0.48 mg/mL)由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學實驗室保存。辣根過氧化物酶(HRP)標記His標簽單克隆抗體購自Thermo Fisher公司;HRP標記兔抗鵝IgG由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學實驗室制備保存。

        1.1.2 主要試劑 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA Marker、T4DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶購自TaKaRa公司。4氯-1-奈酚(4-CN)購自哈爾濱超峰生物科技發(fā)展有限公司。質粒提取試劑、膠回收試劑盒購自上海近岸科技有限公司。蛋白預染Marker購自Thermo Fisher公司。TMB顯色液、TMB顯色終止液購自上海碧云天生物技術有限公司。其余常規(guī)試劑為國產分析純。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 原核表達載體構建 參考單克隆抗體雜交瘤細胞株3D9分泌的抗GPV-NS1蛋白單克隆抗體(IgM型,輕鏈為κ鏈)的VL、VH基因序列[22],依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子進行優(yōu)化后,交由蘇州金唯智生物股份有限公司合成,合成質粒命名為pUC57-VL和pUC57-VH。合成基因的兩端預留BamH Ⅰ和XhoⅠ限制性核酸內切酶酶切位點。用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pUC57-VL和pUC57-VH,回收目的片段VL和VH。將目的片段與同樣雙酶切回收后的表達載體pET-32a連接,轉化大腸桿菌DH5α,涂布含氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL的固體LB平板,37 ℃培養(yǎng)14~16 h。挑取單菌落接種至含有Amp 100 μg/mL的液體LB中,37 ℃培養(yǎng)14~16 h,提取質粒。單、雙酶切鑒定質粒,交由哈爾濱博仕生物科技有限公司進行序列測定。重組質粒分別命名為pET-VL和pET-VH。

        1.2.2 重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-VL和pET-VH分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3),涂布含有Amp 100 μg/mL的固體LB平板。37 ℃培養(yǎng)12~14 h,挑取單菌落,獲得重組菌株。重組菌接種于含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)12~14 h。以1%比例轉接新鮮的含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)2~3 h后,菌液OD600達0.5~0.6時,加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L,37 ℃誘導1~4 h后收獲菌液沉淀,SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白分別命名為TRX-VL和TRX-VH。

        1.2.3 重組蛋白純化及鑒定 重組蛋白經SDS-PAGE電泳后,參照參考文獻[12]的方法切膠純化。采用Bradford檢測法分別對重組蛋白的含量進行測定[13]。純化的重組蛋白經SDS-PAGE后,轉印至硝酸纖維素(NC)膜,5%脫脂乳4 ℃封閉過夜,PBST洗3 遍,參照參考文獻[12]的方法采用HRP標記的His標簽單克隆抗體進行鑒定。

        1.2.4 間接ELISA鑒定TRX-VL、TRX-VH與GST-NS1的結合活性 用0.4 μg的GST-NS1包被酶標板過夜,5% BSA封閉過夜。將重組蛋白TRX-VL和TRX-VH濃度調整為10 μg/mL,加入1∶1,1∶2,1∶5,1∶10,1∶20,1∶40,1∶80稀釋的TRX-VL、TRX-VH蛋白100 μL,以TRX蛋白作為陰性對照、GPV感染鵝血清作為陽性對照,37 ℃孵育1.5 h。之后加入1∶10 000稀釋的HRP標記抗His蛋白單抗或HRP標記兔抗鵝IgG,37 ℃孵育1 h。每次孵育間隔均洗滌3次。用TMB顯色,用酶標儀讀取OD450值。

        1.2.5 阻斷試驗 用0.4 μg的GST-NS1包被酶標板過夜,5% BSA封閉過夜。加入1∶10,1∶100,1∶200,1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000稀釋的GPV感染鵝血清,37 ℃孵育1.5 h。將重組蛋白TRX-VH濃度調整為10 μg/mL,加入1∶2稀釋的TRX-VH蛋白100 μL,37 ℃孵育1.5 h。之后加入1∶10 000稀釋的HRP標記抗His蛋白單抗,37 ℃孵育1 h。每次孵育間隔均洗滌3 次。用TMB顯色,用酶標儀讀取OD450值。

        2 結果與分析

        2.1 重組質粒酶切鑒定

        構建的重組質粒pET-VL和pET-VH分別采用BamHⅠ單酶切和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明,pET-VL經BamHⅠ單酶切獲得了6 240 bp的DNA條帶,BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切獲得了5 900 bp的載體片段和大小為340 bp的目的條帶;pET-VH經BamHⅠ單酶切獲得了6 270 bp的DNA條帶,BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切獲得了5 900 bp的載體片段和大小為370 bp的目的條帶。上述酶切結果與預期一致。測序結果證明外源基因插入載體位置與閱讀框均正確。

        2.2 重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的表達

        將構建的重組質粒pET-VL和pET-VH分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3),經1.0 mmol/L IPTG誘導后1,2,3,4 h進行取樣,SDS-PAGE結果表明,獲得了重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的表達,分子量分別為30.3,31.4 ku,與預期相符(圖1,箭頭所示)。

        2.3 重組蛋白TRX-VL和TRX-VH的純化及鑒定

        重組蛋白TRX-VL和TRX-VH切膠純化,經His標簽單克隆抗體鑒定的結果表明,所獲得的表達蛋白為重組目的蛋白(圖2)。采用Bradford檢測法對重組蛋白的含量進行測定,獲得重組蛋白TRX-VL和TRX-VH濃度分別為0.87,0.74 mg/mL。

        2.4 間接ELISA鑒定TRX-VH、TRX-VL與GST-NS1的結合活性

        間接ELISA鑒定結果表明,TRX-VH對GST-NS1蛋白的結合顯示出了蛋白濃度相關性,結合能力隨著TRX-VH濃度的降低而變弱,在TRX-VH為25 ng(1∶40)時仍顯示出對抗原的一定結合活性;TRX-VL在各包被量下均沒有表現(xiàn)出結合能力(圖3)。

        2.5 阻斷試驗

        阻斷試驗結果表明,用0.4 μg的GST-NS1包被后,1∶10、1∶100和1∶200稀釋的GPV感染鵝血清可完全阻斷TRX-VH與GST-NS1蛋白的結合。1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋的GPV感染鵝血清阻斷能力顯示出濃度相關性,阻斷能力隨著血清濃度的降低而變弱(圖4)。

        3 討論

        天然抗體活性依賴于其復雜的立體結構和某些化學修飾,因此,可通過原核表達天然抗體的小分子片段獲得抗體活性片段[23]。抗體的VH和VL共同組成抗原結合部位,抗體的特異性正是由這一部分決定。目前的基因工程重組抗體以構建VH和VL融合的單鏈抗體(Single-chain Fv,scFv)在原核生物中表達最為普遍[22]。有研究表明,VH片段在抗體與相應抗原的特異性結合過程起主要作用[24-25]。也有報道表明,單獨的VL也能夠與抗原結合[26],甚至有單獨的可變區(qū)CDR3片段結合抗原的報道[27]。這些有活性的小分子抗體片段在臨床應用上具有多方面優(yōu)勢,是替代多、單克隆抗體最有前途的新型抗體。本研究通過對抗GPV NS1單克隆抗體的小分子抗體片段的研究顯示,重組TRX-VH蛋白可以與GST-NS1抗原結合,而TRX-VL無法與GST-NS1抗原結合。王銳[22]制備的抗GST-NS1蛋白單克隆抗體的scFv與GST-NS1重組蛋白的ELISA結合效價為1∶40,與本研究數(shù)值相當,表明VH承擔了scFv的主要結合作用。由于單獨的VL、VH片段不包含F(xiàn)c片段,不易與常規(guī)的酶標二抗結合,給表達的抗體小分子片段的活性檢測帶來不便,為克服這一困難,本研究利用表達的融合蛋白上的標簽蛋白作為檢測標記??紤]到標簽蛋白有可能影響融合蛋白的活性,本研究以TRX標簽蛋白作為對照,試驗結果表明,TRX標簽蛋白不影響TRX-VH與GST-NS1的結合。本研究制備的具有活性的重組TRX-VH蛋白有望替代傳統(tǒng)的多、單克隆抗體,給GPV的相關研究奠定了一定的物質基礎。

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