姜 楠，鄭倩倩，李倩文，涂 健，宋祥軍，邵 穎，劉紅梅，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)的一種典型病原體，會引發(fā)禽類呼吸道感染、敗血癥、頭部腫脹綜合征等多種嚴(yán)重的傳染病[1-2]，該病常與其他病原菌共同作用，引起并發(fā)感染，導(dǎo)致較高死亡率，從而給家禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[3-4]。另外，研究表明APEC的基因組與人尿道致病性大腸桿菌(Urethral pathogenicEscherichiacoli，UPEC)和新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitisEscherichiacoli，NMEC)具有高度同源性[5-7]，提示APEC可能是人類腸外致病性大腸桿菌的毒力基因儲存庫。作為一種人畜共患病的潛在病原體，其血清型復(fù)雜多變，防治仍是當(dāng)今世界性的難題。因此，APEC毒力因子的致病機制研究對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全都尤為重要。

三型分泌系統(tǒng)是革蘭氏陰性致病菌的保守毒力因子之一[8-9]，其分泌的效應(yīng)蛋白是胞外菌主要的毒力致病因子[10]。ETT2作為新鑒定的大腸桿菌三型分泌系統(tǒng)，在致病性大腸桿菌中分布廣泛[11-14]，但由于其缺失嚴(yán)重，曾被認(rèn)為是無功能的分泌系統(tǒng)。然而，最近已有研究證實完整的ETT2系統(tǒng)可以分泌毒力蛋白[15]。伴侶蛋白可以輔助效應(yīng)蛋白正確折疊并易位至宿主細(xì)胞，對效應(yīng)蛋白的分泌及致病作用具有重要意義。由于涉及細(xì)菌與宿主在感染過程中復(fù)雜的相互作用，ETT2分泌效應(yīng)蛋白的發(fā)現(xiàn)和鑒定較為困難，因此，本實驗室希望通過伴侶蛋白結(jié)合互作的方式尋找到與其相關(guān)的分泌效應(yīng)蛋白。本實驗室前期通過生物信息學(xué)分析及氨基酸比對，預(yù)測YgeG為ETT2毒力基因簇中編碼的分子伴侶，并對APEC的生物被膜形成產(chǎn)生一定的影響[16]。經(jīng)預(yù)測，該蛋白分子量較低，二級結(jié)構(gòu)主要為螺旋結(jié)構(gòu)，無ATP結(jié)合域，含有TPR的功能區(qū)，與大部分被證實的T3SS的分子伴侶結(jié)構(gòu)高度相似[16-19]，該蛋白功能尚無相關(guān)研究報道。因此，YegG有望作為伴侶蛋白在ETT2分泌蛋白的尋找方面發(fā)揮重要作用。

本研究以APEC81(AE81)為模板，通過密碼子偏好性優(yōu)化，構(gòu)建ygeG的大腸桿菌原核表達載體pGEX-6p-1-ygeG，誘導(dǎo)YgeG重組蛋白表達，并對其純化鑒定，為其功能活性鑒定及ETT2分泌蛋白的尋找奠定基礎(chǔ)，為闡明ETT2致病機制、控制APEC感染提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 pGEX-6p-1質(zhì)粒由本實驗室保存，禽致病性大腸桿菌APEC81由本實驗室分離鑒定并保存，感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)購于合肥通用生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒、鼠抗GST單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP購自上海生工生物工程有限公司，質(zhì)粒小量提取純化試劑盒購自天根生化科技公司，PAGE凝膠快速配置試劑盒、蛋白上樣緩沖液購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，蛋白Marker分別購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司、Proteintech中國公司，GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自碧云天公司，T4DNA連接酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，T4DNA連接酶購自TaKaRa 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1ygeG基因的分析及密碼子優(yōu)化 參照GenBank上O157：H7 str. Sakai基因組(GenBank：BA000007.3)中ygeG基因序列，設(shè)計ygeG基因特異引物，上游引物ygeG-F：5′-ATGGACACAGAAACAATTGA-3′，下游引物ygeG-R：5′-TTAGCCATTATCTTCTGAAT-3′，以AE81菌液為模板進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，送至生工生物工程(南京)有限公司測序，獲得AE81-ygeG基因序列。通過NCBI BlastN將測序序列與O157：H7 str. Sakai-ygeG比對同源性。利用DNA翻譯氨基酸在線軟件獲得YgeG氨基酸序列，通過大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，得到用于構(gòu)建原核表達載體的ygeG基因序列，送至上海生工生物工程有限公司進行基因合成。

1.2.2ygeG基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建 將優(yōu)化后的ygeG基因序列設(shè)計原核表達特異引物，ygeG-F：5′-CGCGGATCC(BamH Ⅰ識別位點)ATGAACAAAGA

AACCATCGAAAT-3′，下游引物ygeG-R：5′-CCGGAATTC(EcoR Ⅰ識別位點)GTTATCTTCGCTGTTATCGGTCA-3′，以合成的ygeG基因片段為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收，送至生工生物工程(南京)有限公司測序驗證。將測序正確的膠回收產(chǎn)物DNA片段與空載體pGEX-6p-1分別進行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳膠回收。T4DNA連接酶將膠回收的DNA片段與載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，重組子經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定正確后，送生工生物工程(南京)有限公司測序。

1.2.3 重組蛋白的可溶性分析 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ygeG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.6時誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后收集菌體，PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解至液體清亮，離心后收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳驗證。

1.2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化 蛋白表達量通常與誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和IPTG終濃度有關(guān)。通過固定其他條件只改變其中一個條件來分析各單因素對pGEX-6p-1-ygeG表達量的影響。設(shè)置誘導(dǎo)溫度分別為16，28，37 ℃，誘導(dǎo)時間分別為2，4，8，12，16 h，IPTG誘導(dǎo)終濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mmol/L。誘導(dǎo)后收集菌體，PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解至液體清亮，離心后收集上清進行SDS-PAGE電泳驗證。

1.2.5 重組蛋白的純化 將最優(yōu)誘導(dǎo)表達條件下得到的蛋白上清按照GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書操作，采用SDS-PAGE電泳對純化的蛋白進行分析。

1.2.6 Western Blot 鑒定純化后的重組蛋白將純化的YgeG蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，TBST洗滌3次，加入1∶5 000鼠抗GST單克隆抗體作為一抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，加入1∶5 000山羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，HRP-DAB底物顯色液顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ygeG基因的分析及密碼子優(yōu)化

本研究參照GenBank上O157：H7 str. Sakai基因組(GenBank：BA000007.3)中ygeG基因序列，設(shè)計ygeG基因特異引物，擴增出片段大小為486 bp的目的條帶(圖1)，通過NCBI BlastN將測序序列與AE81中ygeG基因序列比對，其基因序列與O157：H7 str. Sakai中ygeG基因序列具有97.12%的同源性。將YgeG氨基酸序列根據(jù)密碼子偏好性優(yōu)化(圖2)。

2.2 ygeG基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建

以優(yōu)化后合成的ygeG基因片段為模板，利用ygeG基因上下游特異優(yōu)化引物進行PCR擴增，結(jié)果如圖3所示，在486 bp處有特異性擴增條帶，符合目的片段的大小。將ygeG基因連接原核表達載體pGEX-6p-1，轉(zhuǎn)化至DH5α。利用pGEX通用引物進行菌體PCR鑒定，空載體為對照，結(jié)果與預(yù)期相符，構(gòu)建好的載體擴增出692 bp條帶，空載擴增出188 bp條帶(圖4)。陽性克隆菌提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定，結(jié)果顯示目的基因條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符，可得到486 bp的目的基因條帶和4 900 bp的載體條帶(圖5)。將經(jīng)酶切驗證正確的重組載體pGEX-6p-1-ygeG進行測序，測序結(jié)果表明重組表達載體構(gòu)建成功。

2.3 pGEX-6p-1-YgeG重組蛋白的可溶性分析

將pGEX-6p-1-ygeG重組菌株誘導(dǎo)后的菌體進行超聲波破碎，離心收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與空載轉(zhuǎn)化菌相比，在44 ku處有一條特異的蛋白表達條帶，分子量與預(yù)期目的蛋白大小相當(dāng)，表明目的蛋白在BL21(DE3)中表達。YgeG重組蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于菌液裂解后的上清中，包涵體中也有一定量的表達(圖6)。由于蛋白主要以可溶性形式表達，且可溶性蛋白具有活性、純化簡單等優(yōu)點，因此，選擇從可溶性蛋白中進行后續(xù)蛋白純化。

2.4 YgeG蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化及SDS-PAGE分析

2.4.1 不同誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達量的影響 在OD600=0.6，IPTG終濃度為0.25 mmol/L以及誘導(dǎo)溫度分別為16，28，37 ℃的條件下，誘導(dǎo)16 h離心收集菌體進行超聲破碎，獲得上清經(jīng)15% 的SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，可溶性目的蛋白的表達量逐漸降低，在16 ℃時，YgeG可溶性目的蛋白的表達量最高(圖7)。

2.4.2 不同誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達量的影響 在OD600=0.6，誘導(dǎo)時間為16 h，IPTG終濃度為0.25 mmol/L的條件下，分別誘導(dǎo)2，4，8，12，16 h 后進行超聲破碎，獲得上清經(jīng)15% 的SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)16 h 時，YgeG可溶性目的蛋白的表達量最高(圖8)。

2.4.3 不同IPTG終濃度對目的蛋白表達量的影響 在OD600=0.6，誘導(dǎo)溫度為16 ℃的條件下，分別加入IPTG至終濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mmol/L，誘導(dǎo)16 h 后進行超聲破碎，獲得上清經(jīng)15%的SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，在IPTG終濃度為0.25 mmol/L時，YgeG可溶性目的蛋白的表達量最高(圖9)。

2.5 pGEX-6p-1-YgeG重組蛋白的純化

將pGEX-6p-1-YgeG重組菌株在最優(yōu)條件下誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎后收集上清，使用GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒將其純化，純化產(chǎn)物GST-YgeG經(jīng)SDS-PAGE驗證，在凝膠泳道上只顯示與目的蛋白大小相符的單一條帶(圖10)。

2.6 pGEX-6p-1-YgeG重組蛋白Western Blot鑒定

以鼠抗GST-tag單克隆抗體為一抗，山羊抗鼠辣根過氧化物酶抗體為二抗，經(jīng)Western Blot 驗證，結(jié)果顯示在純化蛋白的泳道上只出現(xiàn)一條約為44 ku的條帶(圖11)，可見GST-YgeG能與抗GST標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說明GST-YgeG表達成功，具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性。

3 結(jié)論與討論

禽致病性大腸桿菌作為腸道外致病菌具有廣泛的宿主譜，不僅是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要病原菌，而且是人畜共患病的潛在病原體，其防治仍是當(dāng)今世界性的難題[20]。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌在長期進化過程中形成成熟的分泌系統(tǒng)和由毒力島基因編碼的效應(yīng)蛋白，并且靶向地針對宿主的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和生理機理進行破壞，這是許多革蘭氏陰性菌普遍的致病機制之一[21-22]。大腸桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)1和Ⅲ型分泌系統(tǒng)2，Ⅲ型分泌系統(tǒng)2又稱ETT2毒力島[23]。ETT2毒力島廣泛存在于大腸桿菌中，由于缺失嚴(yán)重，一度被認(rèn)為是非功能性的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，但現(xiàn)已被證明與毒力相關(guān)。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)禽致病性大腸桿菌ETT2 ATP酶EviC缺失不僅會影響ETT2的分泌功能，還會對細(xì)菌其他的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。易正飛[15]比較了APEC野生株FJ1B與缺失株eivC差異顯著的分泌蛋白，成功篩選出ETT2參與分泌的效應(yīng)因子EspE3，直接證明了ETT2參與分泌功能。

作為分泌系統(tǒng)的分子伴侶蛋白，其作用是結(jié)合相應(yīng)的效應(yīng)蛋白，保護其在胞質(zhì)內(nèi)不被降解，并有效地分泌、轉(zhuǎn)移效應(yīng)蛋白[25-26]。本實驗室前期通過生物信息學(xué)預(yù)測了新的分子伴侶YgeG，該蛋白與鼠傷寒沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)易位伴侶SicA的氨基酸序列有極高的同源性，此類蛋白主要幫助沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運蛋白SipB和SipC在宿主細(xì)胞膜上形成孔道，同時，蛋白YgeG與已被驗證為伴侶蛋白的大腸桿菌蛋白CesD[27]、沙門氏菌蛋白SicA[28]、耶爾森菌蛋白SycD[29-30]以及志賀氏菌蛋白IpgC[31-32]的氨基酸相似度較高，這些伴侶蛋白可以協(xié)助效應(yīng)蛋白的分泌。故pGEX-6p-1-ygeG的成功構(gòu)建和誘導(dǎo)表達對于ETT2效應(yīng)蛋白的尋找具有重要意義。

由于沒有文獻報道YgeG的功能及其在APEC中的基因序列，為了獲得APEC源的YgeG蛋白，本課題組通過GenBank上O157：H7 str. Sakai基因組中ygeG基因序列設(shè)計了特異性引物，擴增出基因目的條帶，通過測序、比對及翻譯得到APEC-ygeG序列編碼的蛋白氨基酸序列。然而，本課題組嘗試了多種表達體系，均無法獲得APEC-YgeG可溶性蛋白?？紤]到蛋白表達具有密碼子偏好性，筆者對大腸桿菌表達系統(tǒng)進行了密碼子優(yōu)化，進而終于獲得APEC-YgeG可溶性蛋白表達載體，由此提示蛋白的表達系統(tǒng)構(gòu)建過程中，密碼子優(yōu)化可以顯著提升蛋白的可溶性表達效果。

目的蛋白是否可溶及其表達量的多少因蛋白質(zhì)而異，因此，誘導(dǎo)表達的IPTG濃度、溫度和時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整。IPTG是原核表達中常用的誘導(dǎo)劑，對外源蛋白的表達速率和積累量有一定的影響，本試驗在誘導(dǎo)溫度和時間相同的情況下，設(shè)置了5個不同濃度的IPTG，蛋白質(zhì)電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白的可溶性表達量隨著IPTG濃度的增加而增加，IPTG濃度為0.25 mmol/L時的表達量明顯大于其他幾個濃度。通常情況下，細(xì)菌在低溫條件中其生長速度及蛋白表達速度減慢，且包涵體形成減少，更有利于蛋白的可溶性表達。柴政斌等[33]發(fā)現(xiàn)在16 ℃時可溶重組蛋白比例明顯比37 ℃時高。本試驗在誘導(dǎo)時間和IPTG濃度相同的情況下，嘗試了37，28，16 ℃過夜誘導(dǎo)，結(jié)果顯示16 ℃過夜誘導(dǎo)的表達量相對較大。低溫下細(xì)菌生長速度變緩，故選擇通過延長誘導(dǎo)表達時間來增加融合蛋白的表達量，本試驗在誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度相同的情況下，設(shè)置了5個不同的誘導(dǎo)時間，結(jié)果顯示過夜誘導(dǎo)16 h的表達量相對較大。經(jīng)過上述摸索，本研究選擇的最優(yōu)誘導(dǎo)表達條件為：0.25 mmol/L IPTG于16 ℃誘導(dǎo)16 h。在該條件下，目的蛋白YgeG得到了高效表達。

由SDS-PAGE結(jié)果分析可得，YgeG主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中，且通過Western Blot分析可得出，該重組蛋白可與GST標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在44 ku附近出現(xiàn)特異性印跡條帶，說明表達的重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。