戴良香，丁 紅，史曉龍，徐 揚，張冠初，秦斐斐，張智猛

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

根際微生物是緊密附著于根際土壤顆粒中的微生物，其與植物根系相互作用、相互促進(jìn)，參與并擔(dān)負(fù)著根際重要的生理過程，維系著根際的生態(tài)平衡[2]，是土壤與植物間物質(zhì)交換活躍界面的重要成員[3-4]，具有多種生物功能[5]，在植物生長以及對各種生物和非生物脅迫的適應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[6-8]。關(guān)于花生對耐鹽脅迫適應(yīng)性的研究大多集中在品種耐鹽性鑒選[9-12]、光合產(chǎn)物積累與光合效能[13-14]、保護(hù)酶活性變化[15]、養(yǎng)分吸收積累以及種子際細(xì)菌群落變化等方面[16-17]，同時，植物生長促進(jìn)菌的接種，可為植物根系提供抵抗生物和非生物脅迫的緩沖區(qū)，產(chǎn)生各種植物生長促進(jìn)素和生物防治劑，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性并增強(qiáng)養(yǎng)分礦化和有效性[18-19]，研究了黃河三角洲不同含鹽量鹽堿地上花生旺盛生長期0～40 cm根層和旱鹽同時脅迫下花生根際土壤細(xì)菌群落組成及其多樣性[20-21]。目前，關(guān)于鹽脅迫對不同生育期花生根際微生物群落組成的影響研究較少，針對鹽堿土壤花生根際微生物群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢種群及花生生長階段之間的關(guān)系等研究尚不系統(tǒng)[20-22]。本研究擬通過鹽脅迫條件對花生不同生育期根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化和產(chǎn)量的影響，旨在發(fā)現(xiàn)和選擇有益的耐鹽微生物，明確非生物脅迫環(huán)境對微生物群落及功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)掘新的功能類群，發(fā)展鹽堿地花生生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤采用耕地表層土(0～30 cm)，基礎(chǔ)肥力：土壤有機(jī)質(zhì)含量14.08 g/kg，全磷(P2O5)0.84 g/kg，全鉀(K2O)11.26 g/kg，全氮1.70 g/kg，水解氮(N)102.1 mg/kg，速效磷(P2O5)14.7 mg/kg，速效鉀(K2O)113.2 mg/kg，土壤pH值7.1，土壤交換性Na+0.82 cmol/kg，Cl-28.5 mg/kg，土壤含水量9.82%。品種為花育25號(Huayu 25)。

1.2 試驗設(shè)計

采用盆栽試驗，選擇底部直徑為36 cm、高為26 cm的塑料盆，每盆裝土量為18 kg。先將供試土壤風(fēng)干、過1 cm篩后備用。選取飽滿均勻的種子，每盆播6粒，播深均為3 cm，留4株長勢一致的幼苗。

設(shè)置3個鹽脅迫梯度：0.0(Y0)，1.5(Y1)，3.0 g/kg(Y2)，鹽脅迫梯度采用分析純NaCl重量法控制。隨機(jī)區(qū)組排列，6次重復(fù)。分別于開花下針期(播后70 d)、收獲期(播后125 d)以處理和重復(fù)為單位采集根際土壤樣本。采用“抖土法”多點混合方法，即以每處理重復(fù)為單元，“抖土法”收集緊密附著于根系的土壤，每3個重復(fù)根際土壤樣品混合為1個生物學(xué)樣本重復(fù)，每處理分別獲取2個生物學(xué)重復(fù)，密封于滅菌后的離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。于收獲期各處理收獲實測計產(chǎn)，室內(nèi)考察花生出米率、百果質(zhì)量、百仁質(zhì)量，計算莢果產(chǎn)量。

開花下針期各處理土壤樣本分別表示為CK、Y1、Y2，收獲期各處理土壤樣本分別表示為HCK、HY1、HY2。相關(guān)測試由北京諾賽基因公司完成。

1.3 土壤DNA提取

土壤總DNA提取采用OMEGA soil DNA kit試劑盒進(jìn)行，DNA的純度和濃度檢測采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000 分光光度計進(jìn)行。

1.4 16S rRNA文庫構(gòu)建及高通量測序

首先對16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物340F：CCTACGGGNBGCASCAG以及805R：GACTACNV

游學(xué)類教材未能形成系統(tǒng)出版。以在全球范圍內(nèi)傳播中華文化的孔子學(xué)院為例，包含中華文化藝術(shù)因素的立體化教材研發(fā)已是一線教學(xué)人員首先考慮的問題。如何研發(fā)立體化教學(xué)系列，也是游學(xué)教輔材料目前的短板。秉持對外交流和文化輸出的目的，以內(nèi)容立體化、形式立體化和服務(wù)立體化為目標(biāo)，將符合學(xué)習(xí)規(guī)律、實用有趣、貼近生活的內(nèi)容融入游學(xué)教材中，形成游學(xué)類教材的系統(tǒng)出版，研發(fā)適合游學(xué)體系的立體化教材任重道遠(yuǎn)。

GGGTATCTAATCC。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；30個循環(huán)包括(95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)；72 ℃ 7 min。使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，使用0.5×TBE 濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化試劑盒為QIAGEN公司MinElute膠回收試劑盒。

將純化的擴(kuò)增子等摩爾合并，并在Illumina HiSeq2500/NovaSeq 250PE平臺(Illumina，美國圣地亞哥)上進(jìn)行配對末端測序。使用SOAPdenovo對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，將相似性值≥97%的序列定義為同一個OTU進(jìn)行相關(guān)、聚類等分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(Operational taxonomic units)聚類和物種分類分析，得到每個樣品OTUs 和分類譜系的基本分析結(jié)果，再進(jìn)行其豐度和多樣性指數(shù)分析，并在門和綱水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析。最后進(jìn)行物種組成聚類分析、PCoA和PLS-DA統(tǒng)計比較分析，挖掘樣品間的物種組成差異，并結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本根際細(xì)菌群落測序質(zhì)量分析

表1顯示，通過對原始數(shù)據(jù)拼接、過濾，共獲得有效序列(Clean data)893 527條，多數(shù)樣本序列長度在400～500 bp，平均長度在400～500 bp(圖1-A)。各處理花生根際樣本共有2 507個OTUs，存在于CK、Y1和HY2中的OTUs數(shù)分別為59，36，29個，其余3個處理樣本HCK、Y2和HY1中分別為21，16，17個，表明各處理樣本微生物組成基本相似(圖1-B)。

表1 各處理根際樣本測序信息統(tǒng)計Tab.1 The sequencing information statistics of peanut rhizosphere bacterial communities in different treatments

2.1.1 多樣性指數(shù) 表2所示，花生根際細(xì)菌種類豐富度和多樣性受鹽脅迫強(qiáng)度和生育時期的影響。各樣本細(xì)菌群落中OTUs個數(shù)豐富度的Chao1、Ace和Sobs指數(shù)分別為3 308.915 1～3 722.820 3，3 316.230 4～3 684.215 7，2 797.50～3 371.00。反映群落多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)分別為5.606 5～6.979 7，0.002 170～0.027 914。各樣本群落覆蓋度Coverage指數(shù)均大于0.989 4。Y2樣本的Chao1、Ace豐富度指數(shù)和Sobs指數(shù)及HY2的Simpson多樣性指數(shù)均較高，HY2處理的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均表現(xiàn)最低。收獲期土壤根際細(xì)菌種類豐富度和多樣性受鹽脅迫強(qiáng)度的影響較大，較高強(qiáng)度的鹽脅迫濃度使收獲期根際土壤細(xì)菌種類豐富度和多樣性均降低。

表2 各處理樣本Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of rhizosphere soil samples in each treatment

2.1.2 Rank Abundance曲線 各處理下各物種按相對豐度均從高到低依次排列，當(dāng)OTU數(shù)量小于1 000時對應(yīng)的物種相對豐度較高，曲線下降迅速且不平緩，表明其均勻度較低。當(dāng)OTU數(shù)量大于2 000時，曲線較為平緩，表明其在土壤樣本分布較為均勻(圖2)。各處理樣本間的曲線寬度和平滑程度基本一致，不同樣本間物種均勻度無顯著差異。

2.1.3 稀釋性曲線 稀釋曲線可以反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。各樣本在測序量達(dá)到3 500時，曲線均趨于平緩，測序深度足夠，其結(jié)果可覆蓋所測樣本內(nèi)的所有物種，可對微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析(圖3)?；ㄉ煌L期各處理OTU數(shù)量基本一致，均無顯著差異。

2.2 物種組成及樣本間差異比較

2.2.1 門水平全樣本菌落結(jié)構(gòu)分析 所有處理樣本的29個門水平群落物種組成中，其Top11個門(其他合并<0.025)相對豐度之和達(dá)94.87%以上。各處理樣本的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Patescibacteria 7種，其相對豐度均在5.73%以上，其中以變形菌門平均相對豐度最高為31.50%，放線菌門相對豐度為15.48%，綠彎菌門和酸桿菌門相對豐度僅分別為9.96%，8.28%(圖4)。

鹽脅迫明顯提高變形菌門、疣微菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度，尤以開花下針期明顯，其中，變形菌門、疣微菌門和擬桿菌門3個優(yōu)勢菌門Y2處理較其CK分別升高27.00%，114.78%，74.57%，非優(yōu)勢菌門藍(lán)細(xì)菌門是其CK的4.6倍。鹽脅迫明顯降低優(yōu)勢菌門放線菌門、酸桿菌門和Patescibacteria的相對豐度，較其相應(yīng)對照降幅分別為55.58%，26.69%，78.78%?；ㄉH微生物群落組成受鹽脅迫強(qiáng)度和生育時期的影響較大。

2.2.2 綱水平全樣本菌落結(jié)構(gòu)分析 所有處理樣本的72個綱水平群落物種組成中，其top15(其他合并<0.025)的相對豐度之和平均達(dá)86.36%，優(yōu)勢菌綱(相對豐度在5%以上)為放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)等7個菌綱。相對豐度在10%以上的優(yōu)勢菌綱僅有放線菌綱13.15%、α-變形菌綱12.68%和γ-變形菌綱14.65%(圖5)。

鹽脅迫顯著降低兩生育時期放線菌綱和Saccharimonadia的相對豐度，而明顯升高γ-變形菌綱的相對豐度，并均隨鹽脅迫強(qiáng)度的升高而升高。疣微菌綱和擬桿菌綱豐度于開花下針期豐度顯著升高但至成熟期顯著降低。

2.3 根際微生物群落組成比較分析

2.3.1 Beta多樣性分析 基于Unweighted unifrac距離的PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析表明，各處理樣本分布于除第Ⅰ象限外的第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，表明各處理樣本間細(xì)菌群落組成存在明顯差異，除HY2一重復(fù)的樣本點距離較大外，其余處理同一樣本的兩重復(fù)間差異均較小，平行間重復(fù)性較好。橫坐標(biāo)(PC1)和縱坐標(biāo)(PC2)分別可解釋樣品中所有差異的37.3%，24.8%。鹽脅迫下開花下針期樣品集中分布于第Ⅲ象限，物種組成相似度高；CK與收獲期所有處理樣本集中分布于第Ⅱ象限，其物種組成相近(圖6-A)。樣本層級聚類(Hierarchical clustering)結(jié)果表明，所有樣本劃分為4個顯著不同的類群，鹽脅迫下開花下針期和成熟期樣本各聚為一類，兩生育時期對CK各聚為一類。表明鹽脅迫下花生根際細(xì)菌菌群受生長發(fā)育時期影響較大，與無鹽脅迫根際細(xì)菌群落組成有明顯不同(圖6-B)。鹽脅迫處理使根際土壤微生物菌群多樣性的差異增大，受花生生育階段和鹽脅迫強(qiáng)度的影響較大。

2.3.2 PLS-DA(Partial least squares discriminant analysis)分析 通過PLS-DA分析，圖7-A、B可以看出，各處理樣本點離散分布，各樣本菌群組成差異較大，且在目水平和屬水平上組成差異的影響因素相同，即各樣本菌群組成差異受花生生育時期和鹽脅迫程度的影響，鹽脅迫下受生育時期影響較大。

2.4 細(xì)菌群落代謝功能特征

通過PICRUSt2預(yù)測了花生根際細(xì)菌群落的代謝功能特征(COG)。各處理根際細(xì)菌富集的功能主要包括：氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、轉(zhuǎn)錄和碳水化合物的運輸和代謝等。鹽脅迫使各功能基因豐度提高，且與生育時期和鹽脅迫強(qiáng)度有關(guān)，開花下針期以Y1處理各功能基因豐度較高，而至收獲期各功能基因豐度則隨鹽脅迫強(qiáng)度的升高而升高，尤以信號傳遞(翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制重組和修復(fù))、細(xì)胞周期變化(細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分區(qū)、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生)和物質(zhì)能量代謝運輸(能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化、碳

水化合物的運輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝和無機(jī)離子的運輸與代謝等)等功能豐度升幅較大。除未知功能基因外，各處理功能基因總數(shù)為71.07×106～105.23×106，Y2處理最大，Y1處理次之(99.68×106個)，CK和HCK處理最小，分別為71.07×106和71.12×106個。CK預(yù)測功能基因總數(shù)比HY2處理降低32.47%，較Y2降低28.71%(圖8-A)。

使用熱圖分析比較了KEGG level 2級種群代謝功能基因(Top15)表明(圖8-B)，物質(zhì)能量代謝(碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝)、翻譯、復(fù)制和修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及膜運輸?shù)葹橹饕x功能。其中，所有樣本中菌群涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝等功能基因豐度增加，而涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、復(fù)制和修復(fù)、異種生物的生物降解和代謝、其他氨基酸的代謝、折疊，分類和降解等功能的豐度降低。鹽脅迫處理使各功能基因豐度明顯升高，尤以Y1和HY2處理豐富升高明顯，CK和HCK各種功能豐度降低明顯。鹽脅迫和花生生育時期在細(xì)菌種群功能方面起重要作用，有利于優(yōu)勢細(xì)菌功能群豐度提高。

2.5 產(chǎn)量性狀

表2看出，鹽脅迫處理顯著影響花生出米率、百果質(zhì)量、百仁質(zhì)量和產(chǎn)量，且隨鹽脅迫程度的提高作用明顯。鹽脅迫處理的百仁質(zhì)量較CK分別降低32.74%，37.63%，鹽脅迫處理的產(chǎn)量僅為CK處理的50%左右?？梢姡}脅迫嚴(yán)重抑制花生籽仁發(fā)育和產(chǎn)量形成。

表2 鹽脅迫對花生產(chǎn)量及構(gòu)成因素的影響Tab.2 Effects on peanut yield and its components under salt stress

3 討論與結(jié)論

植物根際和根內(nèi)微生物群落具有明顯的根際效應(yīng)，根系分泌物影響附近土壤微環(huán)境中微生物活性和菌群結(jié)構(gòu)，并對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性施加選擇性壓力[23]。此外，土壤特性、植物種類、生長階段和其他脅迫因素也會影響微生物群落組成。黃河三角洲濱海鹽堿土高含鹽量土壤中根際土壤微生物種類、優(yōu)勢種群數(shù)量和群落功能多樣性更為豐富。鹽堿地花生//棉花間作影響二者根層微生物群落的組成，花生//棉花間作使得花生根層土壤變形菌門和放線菌門豐度值降低，花生根際微生物菌群類型與土壤含鹽量和根系分布深度有關(guān)[21，24-26]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫和正常條件下，花生根際微生物群落組成無顯著差異，但其多樣性和豐富度差異受鹽脅迫強(qiáng)度和生育階段的影響。較高強(qiáng)度的鹽脅迫使花生開花下針期根際微生物種類豐富度和多樣性升高，可能由于花生生長階段不同，土壤微環(huán)境和物理化學(xué)性質(zhì)有差異，在根系分泌物因長勢和鹽脅迫逆境調(diào)節(jié)微生物群落組成的同時，也因各種微生物對鹽脅迫逆境的耐受性不同而凋亡或存活，隨后可能會改善植物的生長和耐鹽性。

根系對微生物的“選擇招募”過程與微生物自身的移動性、趨化性、多糖降解性等因素有關(guān)[20，27-29]。根際環(huán)境中纖維弧菌屬(Cellvibrio)和假單胞菌(Pseudomonas)的相對豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非根際土壤，而二者在降解纖維素和好氧反硝化細(xì)菌的過程中發(fā)揮著重要作用[30-31]。 芽單胞菌門對鹽脅迫環(huán)境具有很好的適應(yīng)能力[32]，藍(lán)細(xì)菌可在鹽堿土中生存，通過轉(zhuǎn)化積累土壤中的碳和氮以改善土壤微環(huán)境[33-35]。本試驗條件下，鹽脅迫導(dǎo)致花生根際微生物群落轉(zhuǎn)移和特定微生物種類富集，變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門和藍(lán)細(xì)菌等優(yōu)勢菌門的相對豐度明顯提高，尤以開花下針期明顯。較高的藍(lán)細(xì)菌和芽孢桿菌及旺盛的生長階段，可能有助于花生在鹽脅迫下維持各種生理功能，從而增強(qiáng)花生耐鹽能力。

土壤微生物群落對于植物在鹽脅迫下維持基本功能可能很重要。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫條件下，花生根際細(xì)菌群落涉及物質(zhì)和能量代謝、膜運輸、翻譯、復(fù)制和修復(fù)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等優(yōu)勢細(xì)菌功能基因豐度增加，可以推測這些途徑可能有助于提高花生的耐鹽性。因此，基于植物-微生物互作關(guān)系，充分利用和發(fā)揮根際微生物資源，調(diào)控管理根際微生物群落并保持有益微生物和有害微生物之間的平衡，開發(fā)生物肥料和生物防控劑，對改善土壤肥力、提高作物產(chǎn)量、維持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境健康等具有重要意義。