王振山，袁璽壘，閆留延，楊朋娟，桑璐曼，賈小平，白俊艷

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023)

植物對開花時(shí)間的調(diào)控是對環(huán)境的自我適應(yīng)，也是谷類作物產(chǎn)量的主要決定因素，此過程有許多基因家族一起參與，通過錯(cuò)綜復(fù)雜的分子途徑相結(jié)合來完成。CCT結(jié)構(gòu)域是在擬南芥中最早被報(bào)道的，由擬南芥中CONSTANS(CO)蛋白、CO-LIKE蛋白和TIMING OF CABl(TOCl)蛋白C末端的43個(gè)同源保守氨基酸序列組成[1-2]。根據(jù)CCT中結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和類別，可劃分為3個(gè)亞家族，分別是CMF、COL和PRR亞家族，其中，COL亞家族含有B-box鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，PRR亞家族含有PRR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，而CMF亞家族只有一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域[3]。Cockram等[4]對禾本科植物不同物種CCT家族的基因序列進(jìn)行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，CMF亞家族是在單子葉植物/雙子葉植物進(jìn)化分支后，從COL基因的共同祖先進(jìn)化演變來的，推測COL基因的持續(xù)進(jìn)化導(dǎo)致B-box結(jié)構(gòu)域消失。在相關(guān)的研究中，許多CCT基因都直接或者間接地調(diào)節(jié)植物開花時(shí)間，參與生物鐘調(diào)控，是光信號途徑中的重要一員[1，5-6]。有關(guān)長日照植物擬南芥和短日照植物水稻中CCT家族基因的研究報(bào)道較多，其中CO、TOCl、COL1、COL2、COL9等成員參與花期調(diào)控的遺傳機(jī)制已基本清楚[7-8]。水稻中的Ghd7和玉米中的ZmCCT等，僅僅具有單個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域并且沒有任何其他結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)水稻和玉米的開花時(shí)間和適應(yīng)不同環(huán)境中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[9-10]。

河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院谷子分子育種團(tuán)隊(duì)前期克隆了一個(gè)谷子CCT家族基因(SiCCT)，分析了該基因在不同光周期條件下的晝夜表達(dá)模式和不同光溫組合條件下不同生長期的表達(dá)特點(diǎn)[11]，本研究進(jìn)一步分析SiCCT基因在不同光溫組合條件下的晝夜表達(dá)模式，并檢測該基因在160份谷子資源的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，開展SNP位點(diǎn)與10個(gè)農(nóng)藝性狀間的關(guān)聯(lián)分析，獲得與農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，以進(jìn)一步了解SiCCT基因的光溫響應(yīng)特點(diǎn)和可能的功能效應(yīng)，為揭示該基因參與谷子光溫互作調(diào)控作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

用于SiCCT基因表達(dá)分析的黃毛谷品種來自河北省，用于SiCCT基因SNP位點(diǎn)檢測及關(guān)聯(lián)分析的160份谷子資源來自河南、青海、甘肅、山東、山西、陜西、黑龍江、西藏、寧夏、吉林、遼寧、新疆、內(nèi)蒙古、河北等國內(nèi)各地區(qū)及印度、美國、日本、德國等國家，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所、河北農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所提供。分別于2015-2016年在吉林、河南和海南3個(gè)省種植，3個(gè)地點(diǎn)坐標(biāo)分別是吉林省吉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田(42°31′N，125°40′E)、河南省洛陽市河南科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(34°35′N，112°24′E)、海南省樂東縣九所鎮(zhèn)(18°45′N，109°10′E)。每個(gè)材料種植1行，行長2 m，田間管理按當(dāng)?shù)胤椒ǎ{(diào)查性狀包括株高、穗長、抽穗期、穗粗、穗碼數(shù)、葉片數(shù)、穗質(zhì)量、穗粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量、碼粒數(shù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷子的光溫處理及實(shí)時(shí)熒光定量分析 本研究設(shè)置了長日照高溫(15 h 光照/9 h 黑暗，27 ℃)、短日照高溫(9 h 光照/15 h 黑暗，27 ℃)、長日照低溫(15 h 光照/9 h 黑暗，22 ℃)、短日照低溫(9 h光照/15 h黑暗，22 ℃)共4種不同的光溫組合處理，除光照和溫度外，其余環(huán)境保持一致。挑選大小一致、籽粒飽滿的黃毛谷種子于10 cm×10 cm小方盆中種植80盆，每盆8～10粒種子，于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗的溫室萌發(fā)長至二葉期定苗，每盆保留4株長勢一致的小苗，待三葉期分別轉(zhuǎn)移至4個(gè)不同光溫處理的人工氣候箱培養(yǎng)，每個(gè)處理20盆。小苗長至六葉期時(shí)，從6：00(光照開始)開始取樣，每隔3 h 取一次樣，連續(xù)24 h取樣，采集谷苗頂端1～2片嫩葉于液氮保存。

RNA提取采用康為世紀(jì)有限公司的OmniPlant RNA Kit(DNase Ⅰ)，反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit。SiCCT基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，用引物SiCCT-F-RT/SiCCT-R-RT擴(kuò)增SiCCT基因的特異保守片段，同時(shí)以引物SiActin-F和SiActin-R擴(kuò)增作內(nèi)參，引物信息見表1。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，方法參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑(TaKaRa)的說明書。

表1 熒光定量PCR引物信息Tab.1 Primer information for fluorescence quantitative PCR

1.2.2SiCCT基因SNP位點(diǎn)檢測及群體結(jié)構(gòu)分析、單倍型分析 根據(jù)SiCCT基因在谷子基因組位置信息，從160份谷子重測序數(shù)據(jù)中提取SNP位點(diǎn)，采用Haploview 4.2軟件，對160份谷子中SiCCT基因中的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析、單倍型分析，繪制單體型塊圖(LD Plot)，分析兩兩位點(diǎn)的相關(guān)性，具體方法參見軟件說明書。選取均勻分布于谷子9條染色體上的3 000個(gè)SNP，用Structure 1.8軟件對160份谷子材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析 通過TASSEL 5.0軟件對160份谷子中SiCCT基因的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選取最小等位基因頻率大于0.05的多態(tài)性位點(diǎn)，按要求過濾掉沒有多態(tài)性的位點(diǎn)，然后計(jì)算160份谷子品種間的親緣關(guān)系(K)；將群體結(jié)構(gòu)(Q矩陣)和親緣關(guān)系(K矩陣)作為協(xié)變量，結(jié)合2 a三地相關(guān)的表型數(shù)據(jù)，采用TASSEL軟件中的混合線性模型(Mixed linear model，MLM)方法進(jìn)行分析，篩選出候選基因與主要農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，并估計(jì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)對主要農(nóng)藝性狀的效應(yīng)及貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光溫組合條件下SiCCT 基因的晝夜表達(dá)規(guī)律

由圖1可知，晝夜24 h內(nèi)SiCCT基因表達(dá)具有明顯的節(jié)律性，無論高溫還是低溫，從6：00到21：00均表現(xiàn)相似的表達(dá)模式，即6：00到15：00光照期長日照條件基因表達(dá)量極顯著高于短日照(P<0.01)，18：00長、短日照條件基因表達(dá)水平接近，21：00長日照條件基因表達(dá)量顯著或極顯著高于短日照(P<0.05，P<0.01)。而在24：00到3：00黑暗期高溫低溫間基因表達(dá)模式存在差異，高溫條件只在3：00短日照基因表達(dá)量極顯著高于長日照(P<0.01)，低溫條件24：00，3：00短日照基因表達(dá)量均極顯著高于長日照(P<0.01)，說明溫度對SiCCT基因在黑暗期的表達(dá)有明顯影響。

由圖2可知，在短日照條件下，除了18：00，21：00 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)高溫低溫SiCCT基因表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為低溫環(huán)境基因表達(dá)水平顯著或極顯著高于高溫環(huán)境的特點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)。無論高溫還是低溫，SiCCT基因均有2個(gè)表達(dá)峰，分別在9：00和3：00，為見光3 h之后和黑暗結(jié)束前3 h，說明短日照條件下SiCCT基因的表達(dá)水平受到了溫度的影響，但表達(dá)峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不受影響。在長日照條件下，溫度的作用與短日照相反，除了18：00高溫與低溫間SiCCT基因表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，3：00低溫條件基因表達(dá)量極顯著高于高溫(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為高溫環(huán)境基因表達(dá)水平顯著或極顯著高于低溫環(huán)境的特點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)，不管是高溫還是低溫，SiCCT基因在9：00均有1個(gè)表達(dá)峰。說明溫度對SiCCT基因的調(diào)控作用受光周期條件的制約。

2.2 SiCCT基因的核苷酸多態(tài)性分布

SiCCT基因在160份谷子材料中共檢測出117個(gè)SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)大部分存在于基因3′非翻區(qū)，內(nèi)含子次之，基因5′非翻譯區(qū)和編碼區(qū)最少，這說明SiCCT基因序列的內(nèi)含子區(qū)域和3′非翻譯區(qū)域核苷酸變化的頻率比較高(表2)。

表2 160份谷子材料SiCCT基因的多態(tài)性位點(diǎn)Tab.2 Polymorphic sites of SiCCT gene in 160 millet materials

2.3 SiCCT基因內(nèi)SNP的連鎖不平衡和單倍型分析

本研究對160份谷子品種的SiCCT基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，該基因所有SNP的連鎖情況，各個(gè)方塊的顏色由淺至深表示連鎖程度由低到高，深紅色表示完全連鎖(圖3)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)基因序列上分散分布著一些較強(qiáng)的LD結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，SNP-53與SNP-50、SNP-45、SNP-46、SNP-55、SNP-48，SNP-78與SNP-79、SNP-80、SNP-83、SNP-74，SNP-36與SNP-42、SNP-47、SNP-37，SNP-43與SNP-41、SNP-39、SNP-40，SNP-114與SNP-115、SNP-111、SNP-113，SNP-93與SNP-91、SNP-95，SNP-100與SNP-104，SNP-72與SNP-77，SNP-94與SNP-97，SNP-107與SNP-106，SNP-103與SNP-109，SNP-102與SNP-101之間均存在較強(qiáng)的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)(r2>0.8)。在染色體的某一些區(qū)域，有一些位點(diǎn)緊密相關(guān)，共同遺傳，這樣的區(qū)域一般稱為“單體型塊”，而某些區(qū)域位點(diǎn)相關(guān)性較弱，重組頻繁形成重組區(qū)塊。通過分析得到3個(gè)單體型塊，在第1個(gè)區(qū)塊具有2個(gè)標(biāo)記，分別是SNP-100、SNP-104，有2個(gè)單倍型；第2個(gè)區(qū)塊具有2個(gè)標(biāo)記，分別是SNP-105、SNP-108，有3個(gè)單倍型；在第3個(gè)區(qū)塊具有4個(gè)標(biāo)記，分別是SNP-111、SNP-113、SNP-114、SNP-115，顯示3個(gè)單倍型。

2.4 谷子材料的群體結(jié)構(gòu)分析

采用Structure 1.8軟件對160份谷子品種進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，生成LnP(D)和ΔK隨著K值變化的曲線圖。最佳K值在2個(gè)曲線的拐點(diǎn)處，通過分析比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=3時(shí)，得到一個(gè)穩(wěn)定的a值，此時(shí)ΔK也達(dá)到了峰值，因此最佳K值為3，這表明160個(gè)品種被劃分為3個(gè)主要亞群(圖4)。圖4中3種顏色分別代表了3個(gè)不同的亞群，縱坐標(biāo)表明每個(gè)品種所屬亞群的概率(即Q值)。再采用TASSEL 5.0軟件計(jì)算供試品種間的親緣關(guān)系(K)，相關(guān)親緣關(guān)系信息和群體結(jié)構(gòu)信息應(yīng)用于候選基因的關(guān)聯(lián)分析中。

2.5 SiCCT基因與主要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 5.0軟件，將SiCCT基因117個(gè)SNP數(shù)據(jù)與160份谷子材料2 a三地的10個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，一共11個(gè)SNP位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性效應(yīng)(P<0.05)，與8個(gè)主要農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中在海南樂東短日照環(huán)境檢測到多數(shù)位點(diǎn)與穗粗關(guān)聯(lián)，如SNP-49、SNP-51、SNP-52、SNP-54，而在河南洛陽、吉林吉林長日照環(huán)境檢測到多數(shù)位點(diǎn)與抽穗期、葉片數(shù)、株高、穗長、穗碼數(shù)關(guān)聯(lián)，SNP-49、SNP-52、SNP-70 3個(gè)位點(diǎn)例外，其中SNP-52僅在海南樂東環(huán)境檢測到，SNP-49在河南洛陽也檢測到與穗粗關(guān)聯(lián)，SNP-70在吉林吉林檢測到與穗粒質(zhì)量關(guān)聯(lián)(表 3)。11個(gè)SNP位點(diǎn)多數(shù)能在河南洛陽、吉林吉林或者河南洛陽、海南樂東2個(gè)環(huán)境中同時(shí)檢測到，還有一個(gè)位點(diǎn)SNP-51在3個(gè)環(huán)境均能檢測到，在海南樂東檢測到與穗粗關(guān)聯(lián)，在河南洛陽檢測到與穗碼數(shù)關(guān)聯(lián)，在吉林吉林檢測到與葉片數(shù)關(guān)聯(lián)。

表3 谷子主要農(nóng)藝性狀與SiCCT基因SNP的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Association analysis between main agronomic traits and SNPs of SiCCT in foxtail millet

表3(續(xù))

3 結(jié)論與討論

光周期和溫度是植物開花的2個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因素，植物的成花轉(zhuǎn)變決定于植物對光周期和溫度變化的精確測量[6]。前期的研究表明，SiCCT基因在表達(dá)模式上具有24 h的節(jié)律性變化，在不同光周期條件下具有不同的晝夜表達(dá)模式，不同葉期的相對表達(dá)量也有所不同[11]。為了研究溫度和光周期互作對谷子SiCCT基因晝夜表達(dá)的影響，本試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)不同光溫組合處理來分析SiCCT基因在黃毛谷葉片中的24 h晝夜表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiCCT基因在黃毛谷葉片中的表達(dá)受光周期和溫度共同調(diào)節(jié)。宋遠(yuǎn)麗等[12]研究中發(fā)現(xiàn)，在長日照條件下，低溫(23 ℃)處理促進(jìn)了水稻開花抑制子Ghd7的表達(dá)，表明低溫條件和長日照條件對Ghd7的表達(dá)具有協(xié)同作用。本研究中，黃毛谷葉片SiCCT基因在4種不同光溫組合條件下都呈現(xiàn)24 h晝夜表達(dá)規(guī)律，不管高溫還是低溫，長日照條件下SiCCT基因的晝夜整體表達(dá)水平高于短日照；短日照條件下，低溫處理SiCCT基因的晝夜整體表達(dá)水平高于高溫處理，然而在長日照條件下，低溫處理SiCCT基因的晝夜整體表達(dá)水平低于高溫處理，這與水稻中獲得的結(jié)果相反。前期的研究發(fā)現(xiàn)，高溫與長日照組合對谷子生殖生長抑制作用強(qiáng)于低溫長日照組合[11]，說明長日照條件下溫度的提高使谷子抽穗期延遲，這與SiCCT基因在長日照高溫條件下表達(dá)量增加是一致的，因此，谷子與水稻基因表達(dá)模式的差異可能反映了2種作物光溫互作模式的不同。

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，近年來全基因組關(guān)聯(lián)分析研究進(jìn)展很快。通過對不同品種的重測序，結(jié)合表型進(jìn)行連鎖不平衡分析可直接快速地找到控制重要性狀的位點(diǎn)[13]。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析法已經(jīng)檢測到谷子很多農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)[14-19]。本研究利用前期對160份谷子資源重測序數(shù)據(jù)和表型性狀調(diào)查數(shù)據(jù)，開展基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiCCT基因共檢測到11個(gè)SNP位點(diǎn)與8個(gè)主要農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，且多數(shù)性狀在河南洛陽、吉林吉林長日照環(huán)境下檢測到，只有穗粗、穗粒質(zhì)量、穗質(zhì)量在海南樂東短日照環(huán)境檢測到，說明SiCCT基因的功能受光周期影響。除影響抽穗期外，光周期途徑的許多基因還對其他農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響，具有多重效應(yīng)。蔡云婷等[20]通過克隆得到了玉米的TOC1基因，其與擬南芥光周期調(diào)控基因TOC1高度同源，且位于細(xì)胞核中。小麥中光敏色素互作因子TaPIF4基因不僅受光周期調(diào)控，而且還可能參與植物ABA、干旱、低溫脅迫的信號通路[21]。水稻中Ghd7基因除影響開花期外，還影響穗粒數(shù)[11]。在本研究關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)中，SNP-10不僅與抽穗期相關(guān)，還與葉片數(shù)和穗粒質(zhì)量顯著關(guān)聯(lián)；SNP-100和SNP-104位點(diǎn)在河南洛陽分別同時(shí)都關(guān)聯(lián)到株高、葉片數(shù)和穗長3個(gè)性狀；SNP-51位點(diǎn)連續(xù)2 a在海南樂東與穗粗相關(guān)聯(lián)，連續(xù)2 a在河南洛陽與穗碼數(shù)關(guān)聯(lián)，還連續(xù)2 a在吉林吉林與葉片數(shù)關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果說明，SiCCT基因具有一因多效。

綜上，SiCCT基因受光周期調(diào)控，溫度對SiCCT基因的調(diào)節(jié)作用受光周期條件的制約，具體表現(xiàn)為溫度不能改變SiCCT基因于光照期長日照表達(dá)水平下高于短日照的基本表達(dá)模式，溫度在不同光周期條件下的作用效果相反，短日照條件下低溫表達(dá)水平高于高溫，長日照條件下高溫表達(dá)水平高于低溫。SiCCT基因?qū)χ饕r(nóng)藝性狀的作用受光周期環(huán)境的影響，該基因具有多效性。