高瑞鈺,張 華,宣 寧,柳 絮,張 浩,張夢(mèng)琦,姚方印
(1.山東師范大學(xué),山東 濟(jì)南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所,山東 濟(jì)南 250100)
水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一,抽穗期(Heading date,HD)(開(kāi)花時(shí)間)是影響水稻產(chǎn)量的一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀,也是決定水稻季節(jié)和地區(qū)適應(yīng)性的重要因素[1]。水稻抽穗期受遺傳、光照周期、溫度和養(yǎng)分有效性(如氮水平)等內(nèi)源和外源因素的影響,其中遺傳是影響水稻抽穗期的決定因素[2-3]。
國(guó)內(nèi)外遺傳研究顯示,自分子標(biāo)記輔助選擇(Maker-assisted selection,MAS)應(yīng)用于水稻抽穗期QTL(Quantitative trait locus)定位以來(lái),已報(bào)道超過(guò)100個(gè)QTLs(包括主效和微效)參與水稻開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控[4]。過(guò)去20 a來(lái)已經(jīng)克隆了諸多水稻開(kāi)花調(diào)控基因,受長(zhǎng)日照植物擬南芥成熟開(kāi)花調(diào)控途徑的啟發(fā),通過(guò)分析不同水稻遺傳背景下抽穗期基因的表達(dá),提出了調(diào)控水稻光周期開(kāi)花途徑的2條基本通路:以Hd1為核心的OsGI-Hd1-Hd3a通路和以Ehd1為核心的Ehd1-Hd3a/RFT1通路[5-6]。水稻促開(kāi)花基因Hd1含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,與擬南芥的CO基因在進(jìn)化上具有保守性。Ehd1-Hd3a/RFT1通路是水稻在進(jìn)化上獨(dú)有的[7-8]。Hd1在光周期敏感性開(kāi)花作用中起到了權(quán)衡的作用,在長(zhǎng)日照條件下,Hd1招募Ghd7和DTH8形成不同的二聚體復(fù)合體,DTH8-Hd1通過(guò)結(jié)合Hd3a啟動(dòng)子上的CORE2元件抑制Hd3a的表達(dá)[9-10],協(xié)同抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路以延遲抽穗。但在短日照條件下,Ghd7的表達(dá)量很低,因此,出現(xiàn)Hd1與Ghd7-Hd1、DTH8-Hd1二聚體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)的現(xiàn)象,降低了Ehd1-Hd3a/RFT1通路被二聚體復(fù)合物抑制的作用[11-15]。具有泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性的HAF1參與Hd1的降解,進(jìn)而調(diào)控Hd1的積累[16]。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)Hd1的精確調(diào)控是培育水稻抽穗期多樣性的重要育種目標(biāo)。此外,在水稻中還存在一些獨(dú)立于Hd1和Ehd1調(diào)控路徑的特異開(kāi)花調(diào)控因子,如se14、OsDof12。se14編碼含有Jumonji C(JmjC)結(jié)構(gòu)域的組蛋白脫甲基酶,在長(zhǎng)日照條件下,se14通過(guò)修飾水稻成花素基因RFT1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3去甲基化而抑制水稻抽穗[17]。Dof(DNA-bindingonefinger)轉(zhuǎn)錄因子OsDof12編碼一種與DNA結(jié)合的單指蛋白,在水稻中的表達(dá)沒(méi)有組織特異性,但有時(shí)間特異性,孕育穗時(shí)期的表達(dá)量最高。受光感影響強(qiáng)烈,在長(zhǎng)日照條件下OsDof12通過(guò)上調(diào)Hd3a的表達(dá)促進(jìn)抽穗,在短日條件下沒(méi)有明顯的作用效果[18-19]。
水稻群體中DTH8、Hd1、se14、OsDof12等抽穗期等位基因的自然變異可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)不同的水稻抽穗期表型性狀。利用5個(gè)供體來(lái)源不同的SSSLs(Single segment substitution lines),除代換片段外的其余部分與受體親本HJX74完全相同,因此,它們都是HJX74的近等基因系。本試驗(yàn)采用正向遺傳學(xué)的方法,結(jié)合HJX74和SSSLs在田間的水稻抽穗期表型性狀,通過(guò)比對(duì)CDS序列、氨基酸序列,比較其氨基酸理化性質(zhì)、表達(dá)的差異,進(jìn)一步分析SSSLs代換片段上抽穗期等位基因?qū)SSLs抽穗期的影響。
本試驗(yàn)所用到的SSSLs有:WY18、WY24、WY26、WY60、WY61。SSSLs的具體信息見(jiàn)表1。試驗(yàn)材料種植地點(diǎn)為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)基地(北緯35° 26′,東經(jīng)116°54′),該地區(qū)平均日照時(shí)長(zhǎng)大于14 h,屬于長(zhǎng)日照地區(qū)。單株間距15 cm,行距25 cm,常規(guī)管理。2018年試驗(yàn)材料于5月4日播種,6月4日插秧,7月2日起進(jìn)行抽穗期調(diào)查,每隔3 d進(jìn)行1次,9月30日結(jié)束。2019年試驗(yàn)材料于5月7日播種,6月7日插秧,7月5日起進(jìn)行抽穗期調(diào)查,每隔3 d進(jìn)行1次,9月30日結(jié)束。水稻抽穗期的差異顯著性利用t檢驗(yàn)來(lái)比較,以概率α=0.01為閾值,當(dāng)SSSLs與HJX74抽穗天數(shù)之間的t檢驗(yàn)的P≤ 0.01時(shí),證明該SSSLs的抽穗期變化顯著。
表1 本試驗(yàn)涉及的SSSLs信息Tab.1 The information of SSSLs in this experiment
RNAiso(TaKaRa),PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),Golden Star T6 SuperPCR Mix(1.1×)(TSINGKE),SYBR-Green Mix(TaKaRa),PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(Axygen?),pMD?18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa),DH5α大腸桿菌感受態(tài)(Vazyme)。本研究所有引物均由生工(上海)股份有限公司合成。
本試驗(yàn)所用引物均使用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)。根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已經(jīng)錄入的水稻核苷酸序列,分別在5′UTR和3′UTR設(shè)計(jì)基因克隆所需的引物,在3′端保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量所需引物。本試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表2。
表2 本試驗(yàn)所用的引物Tab.2 Primers in this experiment
提取材料的總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)得到cDNA,以此為模板,使用高保真酶對(duì)目的基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min;循環(huán)(變性94 ℃ 45 s,退火58 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 45 s)30次;延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pMD?18-T Vector Cloning Kit試劑盒的T載體連接,連接體系詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài),涂板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),挑取單克隆,10 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR檢測(cè),挑取陽(yáng)性克隆送至山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序。使用ClustalX軟件進(jìn)行CDS序列以及氨基酸序列比對(duì),輸出的比對(duì)結(jié)果使用Genedoc軟件分析[20],使用ProtParam(https://web.expasy.org/protscale/,https://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列理化性質(zhì)。
于2019年播種后45 d(6月21日)起,采集HJX74、WY18、WY26、WY60的第1片展開(kāi)葉,每隔10 d(標(biāo)記為45,55,65,75,85,95,105,115,125)采集1次。采集時(shí)需使用無(wú)RNA酶的EP管液氮速凍,未及時(shí)使用的葉片速凍后可放于-80 ℃冰箱保存。用RNAiso法提取葉片總RNA,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA的第1鏈,合成體系詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:cDNA模板 2 μL,SYBR-Green Mix 12.5 μL,正向引物 1 μL,反向引物 1 μL,ddH2O 8.5 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃變性10 s,58 ℃退火15 s,延伸72 ℃ 30 s;40個(gè)循環(huán),利用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[21]。
HJX74與SSSLs的抽穗期數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明,5個(gè)SSSLs的抽穗期表型與HJX74有顯著差異,WY18、WY60、WY61表現(xiàn)為晚抽穗,WY24、WY26表現(xiàn)為早抽穗。
表3 HJX74與SSSLs的抽穗期Tab.3 Heading date investigation of HJX74 and SSSLs
WY18DTH8CDS序列和HJX74均為894 bp,有4個(gè)SNP(Single nucleotide polymorphism)的差異,氨基酸序列全長(zhǎng)均為297,有1個(gè)氨基酸的替換。WY24se14CDS序列全長(zhǎng)988 bp,較HJX74相比缺少74 bp。WY26OsDof12CDS序列和HJX74均為1 323 bp,有7個(gè)SNP的替換,氨基酸序列全長(zhǎng)均為440,有3個(gè)氨基酸的差異。WY60DTH8CDS序列和HJX74均為894 bp,有6個(gè)SNP的差異,氨基酸序列為297,有2個(gè)氨基酸的替換。WY61Hd1CDS序列全長(zhǎng)971 bp,較HJX74相比缺少217 bp。HJX74與SSSLs代換片段上抽穗期等位基因的瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1,基因結(jié)構(gòu)繪圖見(jiàn)圖2。
HJX74&WY18DTH8、HJX74&WY26OsDof12和HJX74&WY60DTH83組編碼的氨基酸序列理化性質(zhì)沒(méi)有明顯的差異。HJX74&WY24se14、HJX74&WY61Hd12組的CDS比對(duì)序列缺失差異顯著,故不再進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析。
對(duì)HJX74和WY18DTH8、WY26OsDof12、WY60DTH8進(jìn)行RNA表達(dá)水平的檢測(cè)。提取了HJX74和WY18、WY26、WY60在45,55,65,75,85,95,105,115,125 d葉片的總RNA,通過(guò)qRT-PCR技術(shù)定量分析代換片段上抽穗期等位基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),WY18DTH8的表達(dá)整體高于HJX74。WY60DTH8的表達(dá)曲線與HJX74基本相似,符合兩者的孕育穗時(shí)期。HJX74與WY18、WY26、WY60代換片段上抽穗期等位基因的表達(dá)曲線見(jiàn)圖3。
我國(guó)約60%以上的人口都以稻米為主食,據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公報(bào)(http://www.stats.gov.cn/tjsj/zxfb/202012/t20201210_1808377.html),2020年全國(guó)水稻種植面積3 007.6萬(wàn)hm2,單產(chǎn)達(dá)到7 044 kg/hm2,總產(chǎn)達(dá)21 186.0萬(wàn)t,連續(xù)第10年穩(wěn)定在2億t以上水平。隨著耕地面積持續(xù)減少,提高水稻單產(chǎn)已成為維持我國(guó)糧食安全最現(xiàn)實(shí)的途徑,選擇適宜抽穗期的水稻品種是特定種植區(qū)水稻高產(chǎn)的關(guān)鍵,因此,精確調(diào)控水稻抽穗期對(duì)培育優(yōu)良性狀的水稻品種具有重要的意義[3]。
水稻是一種兼性短日照植物,在水稻的光周期敏感階段,在外源影響因素(營(yíng)養(yǎng)條件、光周期、溫度)一致的情況下,內(nèi)源影響因素基因型遺傳分化是
決定水稻光周期響應(yīng)差異的一個(gè)基本因素,會(huì)導(dǎo)致水稻抽穗期發(fā)生廣泛的變異。為了研究5個(gè)代換片段來(lái)源不同的SSSLs和受體親本HJX74抽穗期差異的原因,利用正向遺傳學(xué)的研究方法,結(jié)合2018-2019年田間種植試驗(yàn)的抽穗期表型性狀,對(duì)代換片段上的抽穗期等位基因的變異進(jìn)行研究,表明WY18DTH8、WY26OsDof12的變異可能并不是引起抽穗期改變的主要原因,可能是該基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)υ摶虻谋磉_(dá)進(jìn)行了調(diào)控,進(jìn)而改變其抽穗期。WY24、WY61抽穗期的變化可能是由其代換片段上等位基因的突變所致,WY60DTH8的變異可能并不是其抽穗期改變的原因。
對(duì)受體親本HJX74與SSSLs代換片段上已克隆的水稻抽穗期等位基因進(jìn)行遺傳分化的研究,通過(guò)發(fā)現(xiàn)等位基因的差異,分析不同等位基因型對(duì)抽穗期表型性狀的影響,對(duì)于不同等位基因在水稻育種的有效利用具有重要意義。另外,對(duì)于WY18、WY26和WY60,下一步試驗(yàn)可以通過(guò)配置合適的雜交組合,進(jìn)一步挖掘代換片段上可能存在的新的抽穗期基因,以希望能夠?qū)λ境樗肫谥骰蚧騋TLs的作用機(jī)制方面得到更多的啟示。