高瑞鈺，張 華，宣 寧，柳 絮，張 浩，張夢(mèng)琦，姚方印

(1.山東師范大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，抽穗期(Heading date，HD)(開(kāi)花時(shí)間)是影響水稻產(chǎn)量的一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，也是決定水稻季節(jié)和地區(qū)適應(yīng)性的重要因素[1]。水稻抽穗期受遺傳、光照周期、溫度和養(yǎng)分有效性(如氮水平)等內(nèi)源和外源因素的影響，其中遺傳是影響水稻抽穗期的決定因素[2-3]。

國(guó)內(nèi)外遺傳研究顯示，自分子標(biāo)記輔助選擇(Maker-assisted selection，MAS)應(yīng)用于水稻抽穗期QTL(Quantitative trait locus)定位以來(lái)，已報(bào)道超過(guò)100個(gè)QTLs(包括主效和微效)參與水稻開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控[4]。過(guò)去20 a來(lái)已經(jīng)克隆了諸多水稻開(kāi)花調(diào)控基因，受長(zhǎng)日照植物擬南芥成熟開(kāi)花調(diào)控途徑的啟發(fā)，通過(guò)分析不同水稻遺傳背景下抽穗期基因的表達(dá)，提出了調(diào)控水稻光周期開(kāi)花途徑的2條基本通路：以Hd1為核心的OsGI-Hd1-Hd3a通路和以Ehd1為核心的Ehd1-Hd3a/RFT1通路[5-6]。水稻促開(kāi)花基因Hd1含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，與擬南芥的CO基因在進(jìn)化上具有保守性。Ehd1-Hd3a/RFT1通路是水稻在進(jìn)化上獨(dú)有的[7-8]。Hd1在光周期敏感性開(kāi)花作用中起到了權(quán)衡的作用，在長(zhǎng)日照條件下，Hd1招募Ghd7和DTH8形成不同的二聚體復(fù)合體，DTH8-Hd1通過(guò)結(jié)合Hd3a啟動(dòng)子上的CORE2元件抑制Hd3a的表達(dá)[9-10]，協(xié)同抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路以延遲抽穗。但在短日照條件下，Ghd7的表達(dá)量很低，因此，出現(xiàn)Hd1與Ghd7-Hd1、DTH8-Hd1二聚體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)的現(xiàn)象，降低了Ehd1-Hd3a/RFT1通路被二聚體復(fù)合物抑制的作用[11-15]。具有泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性的HAF1參與Hd1的降解，進(jìn)而調(diào)控Hd1的積累[16]。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hd1的精確調(diào)控是培育水稻抽穗期多樣性的重要育種目標(biāo)。此外，在水稻中還存在一些獨(dú)立于Hd1和Ehd1調(diào)控路徑的特異開(kāi)花調(diào)控因子，如se14、OsDof12。se14編碼含有Jumonji C(JmjC)結(jié)構(gòu)域的組蛋白脫甲基酶，在長(zhǎng)日照條件下，se14通過(guò)修飾水稻成花素基因RFT1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3去甲基化而抑制水稻抽穗[17]。Dof(DNA-bindingonefinger)轉(zhuǎn)錄因子OsDof12編碼一種與DNA結(jié)合的單指蛋白，在水稻中的表達(dá)沒(méi)有組織特異性，但有時(shí)間特異性，孕育穗時(shí)期的表達(dá)量最高。受光感影響強(qiáng)烈，在長(zhǎng)日照條件下OsDof12通過(guò)上調(diào)Hd3a的表達(dá)促進(jìn)抽穗，在短日條件下沒(méi)有明顯的作用效果[18-19]。

水稻群體中DTH8、Hd1、se14、OsDof12等抽穗期等位基因的自然變異可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)不同的水稻抽穗期表型性狀。利用5個(gè)供體來(lái)源不同的SSSLs(Single segment substitution lines)，除代換片段外的其余部分與受體親本HJX74完全相同，因此，它們都是HJX74的近等基因系。本試驗(yàn)采用正向遺傳學(xué)的方法，結(jié)合HJX74和SSSLs在田間的水稻抽穗期表型性狀，通過(guò)比對(duì)CDS序列、氨基酸序列，比較其氨基酸理化性質(zhì)、表達(dá)的差異，進(jìn)一步分析SSSLs代換片段上抽穗期等位基因?qū)SSLs抽穗期的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料種植

本試驗(yàn)所用到的SSSLs有：WY18、WY24、WY26、WY60、WY61。SSSLs的具體信息見(jiàn)表1。試驗(yàn)材料種植地點(diǎn)為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)基地(北緯35° 26′，東經(jīng)116°54′)，該地區(qū)平均日照時(shí)長(zhǎng)大于14 h，屬于長(zhǎng)日照地區(qū)。單株間距15 cm，行距25 cm，常規(guī)管理。2018年試驗(yàn)材料于5月4日播種，6月4日插秧，7月2日起進(jìn)行抽穗期調(diào)查，每隔3 d進(jìn)行1次，9月30日結(jié)束。2019年試驗(yàn)材料于5月7日播種，6月7日插秧，7月5日起進(jìn)行抽穗期調(diào)查，每隔3 d進(jìn)行1次，9月30日結(jié)束。水稻抽穗期的差異顯著性利用t檢驗(yàn)來(lái)比較，以概率α=0.01為閾值，當(dāng)SSSLs與HJX74抽穗天數(shù)之間的t檢驗(yàn)的P≤ 0.01時(shí)，證明該SSSLs的抽穗期變化顯著。

表1 本試驗(yàn)涉及的SSSLs信息Tab.1 The information of SSSLs in this experiment

1.2 主要試劑

RNAiso(TaKaRa)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)，Golden Star T6 SuperPCR Mix(1.1×)(TSINGKE)，SYBR-Green Mix(TaKaRa)，PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(Axygen?)，pMD?18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)，DH5α大腸桿菌感受態(tài)(Vazyme)。本研究所有引物均由生工(上海)股份有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)所用引物均使用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)。根據(jù)NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)已經(jīng)錄入的水稻核苷酸序列，分別在5′UTR和3′UTR設(shè)計(jì)基因克隆所需的引物，在3′端保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量所需引物。本試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表2。

表2 本試驗(yàn)所用的引物Tab.2 Primers in this experiment

1.4 基因克隆與序列分析

提取材料的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)得到cDNA，以此為模板，使用高保真酶對(duì)目的基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min;循環(huán)(變性94 ℃ 45 s，退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s)30次;延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pMD?18-T Vector Cloning Kit試劑盒的T載體連接，連接體系詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，涂板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆，10 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性克隆送至山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序。使用ClustalX軟件進(jìn)行CDS序列以及氨基酸序列比對(duì)，輸出的比對(duì)結(jié)果使用Genedoc軟件分析[20]，使用ProtParam(https：//web.expasy.org/protscale/，https：//web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列理化性質(zhì)。

1.5 用qRT-PCR驗(yàn)證代換片段上抽穗期等位基因的表達(dá)

于2019年播種后45 d(6月21日)起，采集HJX74、WY18、WY26、WY60的第1片展開(kāi)葉，每隔10 d(標(biāo)記為45，55，65，75，85，95，105，115，125)采集1次。采集時(shí)需使用無(wú)RNA酶的EP管液氮速凍，未及時(shí)使用的葉片速凍后可放于-80 ℃冰箱保存。用RNAiso法提取葉片總RNA，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA的第1鏈，合成體系詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA模板 2 μL，SYBR-Green Mix 12.5 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，ddH2O 8.5 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，延伸72 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)，利用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單片段代換系抽穗期表型性狀分析

HJX74與SSSLs的抽穗期數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，5個(gè)SSSLs的抽穗期表型與HJX74有顯著差異，WY18、WY60、WY61表現(xiàn)為晚抽穗，WY24、WY26表現(xiàn)為早抽穗。

表3 HJX74與SSSLs的抽穗期Tab.3 Heading date investigation of HJX74 and SSSLs

2.2 代換片段上的抽穗期等位基因的變異

WY18DTH8CDS序列和HJX74均為894 bp，有4個(gè)SNP(Single nucleotide polymorphism)的差異，氨基酸序列全長(zhǎng)均為297，有1個(gè)氨基酸的替換。WY24se14CDS序列全長(zhǎng)988 bp，較HJX74相比缺少74 bp。WY26OsDof12CDS序列和HJX74均為1 323 bp，有7個(gè)SNP的替換，氨基酸序列全長(zhǎng)均為440，有3個(gè)氨基酸的差異。WY60DTH8CDS序列和HJX74均為894 bp，有6個(gè)SNP的差異，氨基酸序列為297，有2個(gè)氨基酸的替換。WY61Hd1CDS序列全長(zhǎng)971 bp，較HJX74相比缺少217 bp。HJX74與SSSLs代換片段上抽穗期等位基因的瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，基因結(jié)構(gòu)繪圖見(jiàn)圖2。

2.3 單片段代換系代換片段上抽穗期等位基因氨基酸理化性質(zhì)分析

HJX74&WY18DTH8、HJX74&WY26OsDof12和HJX74&WY60DTH83組編碼的氨基酸序列理化性質(zhì)沒(méi)有明顯的差異。HJX74&WY24se14、HJX74&WY61Hd12組的CDS比對(duì)序列缺失差異顯著，故不再進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析。

2.4 抽穗期等位基因的qRT-PCR分析

對(duì)HJX74和WY18DTH8、WY26OsDof12、WY60DTH8進(jìn)行RNA表達(dá)水平的檢測(cè)。提取了HJX74和WY18、WY26、WY60在45，55，65，75，85，95，105，115，125 d葉片的總RNA，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)定量分析代換片段上抽穗期等位基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WY18DTH8的表達(dá)整體高于HJX74。WY60DTH8的表達(dá)曲線與HJX74基本相似，符合兩者的孕育穗時(shí)期。HJX74與WY18、WY26、WY60代換片段上抽穗期等位基因的表達(dá)曲線見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)約60%以上的人口都以稻米為主食，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公報(bào)(http：//www.stats.gov.cn/tjsj/zxfb/202012/t20201210_1808377.html)，2020年全國(guó)水稻種植面積3 007.6萬(wàn)hm2，單產(chǎn)達(dá)到7 044 kg/hm2，總產(chǎn)達(dá)21 186.0萬(wàn)t，連續(xù)第10年穩(wěn)定在2億t以上水平。隨著耕地面積持續(xù)減少，提高水稻單產(chǎn)已成為維持我國(guó)糧食安全最現(xiàn)實(shí)的途徑，選擇適宜抽穗期的水稻品種是特定種植區(qū)水稻高產(chǎn)的關(guān)鍵，因此，精確調(diào)控水稻抽穗期對(duì)培育優(yōu)良性狀的水稻品種具有重要的意義[3]。

水稻是一種兼性短日照植物，在水稻的光周期敏感階段，在外源影響因素(營(yíng)養(yǎng)條件、光周期、溫度)一致的情況下，內(nèi)源影響因素基因型遺傳分化是

決定水稻光周期響應(yīng)差異的一個(gè)基本因素，會(huì)導(dǎo)致水稻抽穗期發(fā)生廣泛的變異。為了研究5個(gè)代換片段來(lái)源不同的SSSLs和受體親本HJX74抽穗期差異的原因，利用正向遺傳學(xué)的研究方法，結(jié)合2018-2019年田間種植試驗(yàn)的抽穗期表型性狀，對(duì)代換片段上的抽穗期等位基因的變異進(jìn)行研究，表明WY18DTH8、WY26OsDof12的變異可能并不是引起抽穗期改變的主要原因，可能是該基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)υ摶虻谋磉_(dá)進(jìn)行了調(diào)控，進(jìn)而改變其抽穗期。WY24、WY61抽穗期的變化可能是由其代換片段上等位基因的突變所致，WY60DTH8的變異可能并不是其抽穗期改變的原因。

對(duì)受體親本HJX74與SSSLs代換片段上已克隆的水稻抽穗期等位基因進(jìn)行遺傳分化的研究，通過(guò)發(fā)現(xiàn)等位基因的差異，分析不同等位基因型對(duì)抽穗期表型性狀的影響，對(duì)于不同等位基因在水稻育種的有效利用具有重要意義。另外，對(duì)于WY18、WY26和WY60，下一步試驗(yàn)可以通過(guò)配置合適的雜交組合，進(jìn)一步挖掘代換片段上可能存在的新的抽穗期基因，以希望能夠?qū)λ境樗肫谥骰蚧騋TLs的作用機(jī)制方面得到更多的啟示。