雷其冬，孫旭東，徐慧妮

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.中國(guó)科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

TCP4是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子TCP(Teosinte branched1，cycloidea，proliferating cell factors)家族成員之一，影響多種植物激素的合成，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]，例如主根、側(cè)根、葉片形態(tài)、花蕊形成、表皮毛分化、子葉舒展、下胚軸延伸、避蔭反應(yīng)、植物油脂合成等過(guò)程[2]。轉(zhuǎn)錄因子TCP4在植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)過(guò)程中與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種蛋白(如MYB、SAP11)相互作用[3-5]，可能在植物抵抗生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[5]。在植物發(fā)育過(guò)程中TCP4還具有時(shí)空限制的表達(dá)模式，這些表達(dá)模式提高了TCP4在局部觸發(fā)或拮抗激素信號(hào)傳導(dǎo)的可能性[6]。TCP4具有非典型的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域，因此,轉(zhuǎn)錄因子TCP4能夠與功能基因的順式作用元件結(jié)合調(diào)控其表達(dá)[7]，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活。近10多年來(lái)的研究揭示了部分TCP4的功能和分子機(jī)制，但這些研究仍處于初級(jí)階段[8]。

本研究克隆了擬南芥AtTCP4基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)以獲得有蛋白活性的AtTCP4，旨在為進(jìn)一步揭示TCP4在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用和調(diào)控靶基因的鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供，大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，載體pET-28a購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 AtTCP4的克隆以及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用Promega有限公司的Eastep?Super 總RNA提取試劑盒，從擬南芥葉片中提取總RNA，利用EvaGreen 2×qPCR MasterMix-ROX試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TCP4序列(基因登錄號(hào)AT3G15030)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，EZ-TCP4-EcoRⅠ-F：CGCGGATCCGAATTCATGTCTGACGACCAA，EZ-HindⅢ-R：TGCGGCCGCAAGCTTTCAATGGCGAGAAAT，利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒對(duì)TCP4進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃ ∞。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收純化(Omega Bio-Tek公司 E. Z. N. A?Gel Extraction Kit試劑盒)。采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司同源重組試劑盒，并加入TCP4膠回收片段以及pET-28a載體雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，然后將陽(yáng)性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 重組菌株pET-28a-AtTCP4的誘導(dǎo)和表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒 pET-28a-AtTCP4轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中，取1 μL重組菌株菌液接種到3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過(guò)夜活化。將活化后菌液吸取100 μL再接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8。加入1 mmol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)4 h或18 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。各取2 mL菌液，離心收集菌體。加入60 μL的蛋白Loading Buffer吹打混勻，沸水浴5～10 min，冰上冷卻1 min，離心進(jìn)行電泳分析。

1.4 蛋白純化

采用Promega公司Magne HisTMProtein Purification System試劑盒純化蛋白。將細(xì)胞沉淀重懸于100 μL Fast BreakTM細(xì)胞裂解液中，室溫渦旋孵育2 h。加入30 μL Magne HisTMNi顆粒，4 ℃渦旋孵育 2 h，確保Magne HisTMNi顆?；旌暇鶆颉Ｔ嚬芊胖么帕苤屑s30 s，以捕獲Magne HisTMNi顆粒，棄上清液。加入150 μL Magne HisTM洗滌緩沖液，顛倒混勻，棄上清液。重復(fù)洗滌3次。加入洗脫緩沖液100 μL，室溫靜止1～2 min，放置在磁力架中約30 s，吸取含有純化蛋白的上清液。進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染液驗(yàn)證是否純化成功。

1.5 Western Blot檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍?/h3>

樣品加入等體積蛋白Loading Buffer，煮沸5 min，冰上冷卻1 min，12 000 r/min、離心1 min[9]，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后，轉(zhuǎn)PVDF膜，使用His抗體通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)蛋白[10]。

1.6 EMSA分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢LOX2基因啟動(dòng)子序列，通過(guò)PLANT CARE網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析其啟動(dòng)子序列是否有bHLH結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)，確認(rèn)LOX2基因啟動(dòng)子序列含有轉(zhuǎn)錄因子TCP4順式作用元件。由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)探針和競(jìng)爭(zhēng)性探針，采用化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)驗(yàn)證TCP4蛋白與探針的結(jié)合。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子AtTCP4生物信息學(xué)分析

通過(guò)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https：//www.arabidopsis.org/)查詢轉(zhuǎn)錄因子AtTCP4基因序列以及蛋白序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子TCP家族進(jìn)行蛋白序列比較以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其結(jié)果見(jiàn)圖1-A、B。擬南芥TCP家族基因編碼區(qū)由Basic、Helix Ⅰ、Loop和Helix Ⅱ結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，因此，轉(zhuǎn)錄因子TCP4能夠與功能基因的順式作用元件結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)堿基序列不同，將TCP家族分為兩大類：Ⅰ類(GGNCCCAC)和Ⅱ類(GTGGNCC)。Ⅱ類又分為CYC/TBI、CIN兩大類，CIN包括TCP10、TCP3、TCP4、TCP2、TCP24、TCP13、TCP5、TCP17。對(duì)TCP4蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)圖1-C。轉(zhuǎn)錄因子TCP4可以形成同源二聚體，與水稻轉(zhuǎn)錄因子PCF6三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)70.04%。

2.2 AtTCP4基因克隆以及原核載體構(gòu)建

從野生型擬南芥中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)AtTCP4進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得1 200 bp 左右的特異性條帶(圖2-A)，與AtTCP4開放閱讀框長(zhǎng)度相同。對(duì)其進(jìn)行膠回收、純化，連接到pET-28a載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α篩選培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖2-B)，獲得陽(yáng)性重組子。對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)目的基因已連接到pET-28a質(zhì)粒，表明成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-AtTCP4。

2.3 重組菌株pET-28a-AtTCP4的誘導(dǎo)和表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒 pET-28a-AtTCP4轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR，鑒定陽(yáng)性菌株。將含重組質(zhì)粒 pET-28a-AtTCP4的菌株在37 ℃搖床搖至OD600=0.8，加入1 mmol/L IPTG、28 ℃誘導(dǎo)4 h或18 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。

將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行4 ℃、10 000 r/min離心，棄上清液，收集沉淀。加入60 μL的蛋白Loading Buffer吹打混勻沸水浴5～10 min，置于冰上冷卻1 min，離心提取總蛋白，進(jìn)行電泳分析。SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，在約75 ku 位置出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶(圖3-A)。采用Promega公司Magne HisTMProtein Purification System試劑盒純化AtTCP4蛋白，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，在約75 ku 位置出現(xiàn)單一的蛋白條帶(圖3-B)。

2.4 Western Blot檢測(cè)AtTCP4蛋白

將誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白經(jīng)過(guò)Magen HisTMProtein Purification System試劑盒純化，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，在75 ku位置處出現(xiàn)了目的蛋白，與預(yù)期一致(圖4)。將純化的AtTCP4蛋白凍存于-80 ℃。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子AtTCP4與LOX2基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合

根據(jù)順式作用元件設(shè)計(jì)探針和競(jìng)爭(zhēng)性探針，凝膠電泳遷移試驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證AtTCP4蛋白與探針結(jié)合情況，結(jié)果如圖5所示，AtTCP4蛋白與探針結(jié)合，當(dāng)加入競(jìng)爭(zhēng)性探針后，條帶變暗。證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子AtTCP4與LOX2基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。

3 討論

TCP家族是保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)擬南芥TCP家族進(jìn)行多序列比對(duì)，TCP家族基因編碼區(qū)是由55～59個(gè)氨基酸組成的非典型的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域。水稻轉(zhuǎn)錄因子OsTCP家族在140～240位置包含一個(gè)bHLH結(jié)構(gòu)域[11]。Liu等[12]通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析表明，TCP家族基因在陸生植物之間具有保守性。番茄基因組中有30個(gè)SlTCP基因，蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹將轉(zhuǎn)錄因子SlTCP家族分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類的TCP結(jié)構(gòu)域相比Ⅱ類缺少4個(gè)氨基酸[13]。Ⅱ類TCP家族含有一個(gè)富含精氨酸的殘基基序(R結(jié)構(gòu)域)[14]和一個(gè)谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸伸展結(jié)構(gòu)域[15]，其功能是未知的。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)堿基不同，可將擬南芥TCP蛋白分為Ⅰ類和Ⅱ類。正是因?yàn)榻Y(jié)合位點(diǎn)堿基不同，轉(zhuǎn)錄因子TCP與順式作用元件結(jié)合具有多樣性，能夠調(diào)控更多功能基因的表達(dá)，參與植物生理生化過(guò)程，響應(yīng)外界刺激調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[16]。TCP蛋白可以形成同源二聚體和異源二聚體，但異源二聚體比同源二聚體更有效結(jié)合到DNA啟動(dòng)子區(qū)域。因此，同源或異源二聚體識(shí)別順式調(diào)控元件時(shí)具有不同的親和力，所以功能基因的表達(dá)量也有所不同[17]。這會(huì)使調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜性和特異性。

研究表明，擬南芥AtTCP4主要在子葉和幼葉中表達(dá)并調(diào)節(jié)這些組織器官的形態(tài)[18]，還可與一些功能基因的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控多種植物激素的合成，從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。在JA信號(hào)途徑中，Lipoxygenase2(LOX2)基因受TCP轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，該基因編碼參與由α-亞麻酸合成 JA途徑的葉綠體酶，LOX2的誘導(dǎo)使JA積累最終促進(jìn)葉片衰老[19]。本研究通過(guò)構(gòu)建原核載體，誘導(dǎo)純化獲得AtTCP4蛋白。利用EMSA試驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子TCP4能夠結(jié)合到LOX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控LOX2基因的表達(dá)，從而參與植物激素的合成。AtTCP4蛋白的獲得為進(jìn)一步了解其蛋白結(jié)構(gòu)提供試驗(yàn)材料，同時(shí)為蛋白質(zhì)伴侶的鑒定和其他下游功能基因的確定奠定了基礎(chǔ)[20]。