徐 歡，段盛文，馮湘沅，鄭 科，楊 琦，汪啟明，成莉鳳，彭源德

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

苧麻是重要的天然纖維原料，其纖維具有防臭抑菌、透氣抗電、清涼舒爽等優(yōu)良品質(zhì)，其他纖維無法替代。苧麻原料中除含有天然纖維外，還包含許多果膠等“膠質(zhì)”成分。要獲得苧麻中的纖維，必須經(jīng)過“脫膠”處理[1]。傳統(tǒng)的漚麻工藝效率低，對環(huán)境污染嚴(yán)重、水資源嚴(yán)重浪費(fèi)，化學(xué)脫膠工藝能耗高、成本高、纖維品質(zhì)劣化，而生物脫膠具有節(jié)能、環(huán)保、高效的優(yōu)點(diǎn)，為苧麻脫膠的發(fā)展方向[2-3]。

生物脫膠需要一系列酶協(xié)同完成，其中果膠酶是苧麻生物脫膠關(guān)鍵因子之一，而脫膠果膠酶的主要成分是果膠裂解酶(Pectate lyase，PEL，EC 4.2.2.2)[2]。PEL對果膠底物的親和力與果膠甲酯化程度呈正相關(guān)，可直接通過反式消除作用隨機(jī)切割甲酯化果膠的α-1，4糖苷鍵，在果膠非還原性末端的C5處消去一個(gè)氫原子到還原性末端的C1處生成羥基，非還原性末端生成帶不飽和雙鍵的聚半乳糖醛酸[4]。據(jù)報(bào)道，BacilluslicheniformisHDYM-03、PaenibacilluspolymyxaKF-1、PectobacteriumcarotovorumHG-49和DickeyadadantiiDCE-01是目前可用于工業(yè)化苧麻生物脫膠的微生物[5-8]。從這些苧麻脫膠微生物中發(fā)掘優(yōu)良果膠裂解酶并使其高效表達(dá)，是一條提高脫膠果膠裂解酶研究效率的有效途徑。多基因家族編碼的PEL廣泛存在于微生物中，且降解來源不同果膠的功能特性存在明顯差異[9-11]。因此，PEL脫膠功能特性與脫膠機(jī)制一直是生物脫膠領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，但在苧麻生物脫膠功能特征上的研究報(bào)道[12]相對較少[12]。本研究擬在篩選得到苧麻高效脫膠菌株D.dadantiiDCE-01[1]，并將其PEL基因pelG403克隆至質(zhì)粒pEASY-Blunt E1的基礎(chǔ)上，將pelG403基因更換至質(zhì)?？截悢?shù)更高的pET28a載體中，誘導(dǎo)其高效表達(dá)，同時(shí)對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，探索苧麻脫膠果膠裂解酶基因pelG403高效表達(dá)的方法和途徑，并為脫膠果膠裂解酶關(guān)鍵位點(diǎn)分析、分子改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與載體 pEASY-Blunt E1-G403/BL21工程菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所生物加工研究室構(gòu)建與保藏；表達(dá)載體pET28a、原核克隆感受態(tài)E.coliTOP10與原核表達(dá)感受態(tài)E.coliBL21(DE3)均購自Novagen公司。

1.1.2 主要試劑 超強(qiáng)高保真PCR試劑盒Ultra HiFidelity PCR Kit、DNA Marker Ⅲ、IPTG、卡那霉素(Kan)、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自天根生物公司；其余常規(guī)化學(xué)試劑等商業(yè)化產(chǎn)品購自國藥集團(tuán)；引物合成和DNA序列測定由長沙擎科生物公司完成。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，BioRad公司；凝膠快速成像儀，Vilber公司；冷凍離心機(jī)，Sigma公司；核酸電泳槽，北京六一公司；核酸濃度檢測儀，Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀，Thermo Fisher公司；振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1pelG403基因克隆 根據(jù)果膠裂解酶基因pelG403的堿基序列(GenBank登錄號：JX964998)，利用生物信息學(xué)軟件SnapGene設(shè)計(jì)引物。正向引物和反向引物分別帶入限制性酶切位點(diǎn)NdeⅠ和XhoⅠ，正向引物F的序列：5′-CGCATATGATGCCCATCTCACA

TTTTTC-3′(劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn))，反向引物R的序列：5′-CCTCGAGTTATTTACAAGCTGAGCTGG-3′(劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

以pEASY-Blunt E1-G403重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：質(zhì)粒模板1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.75 μL，2×UltraHiFi Mix 12.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR參數(shù)設(shè)置：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃，5 min。凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物后回收目的片段，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ分別對回收的目的片段和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行酶切；回收酶切后的pelG403目的片段和pET28a載體片段，加入T4DNA 連接酶過夜，獲得重組質(zhì)粒pET28a-G403(圖1)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTOP10克隆感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Kan抗性平板培養(yǎng)16～20 h；挑選典型單菌落，經(jīng)PCR鑒定后送至長沙擎科公司進(jìn)行核酸測序驗(yàn)證。

1.2.2 果膠裂解酶PelG403的誘導(dǎo)表達(dá) 取測序檢驗(yàn)正確的工程菌pET28a-G403/TOP至Kan抗性LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)12 h后抽提質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET28a-G403轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)中，經(jīng)Kan抗性平板篩選，挑選典型陽性克隆接種于Kan抗性篩選的LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至菌體OD600為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)，28 ℃，150 r/min誘導(dǎo)PelG403表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白的檢測分析 SDS-PAGE檢測：取 1 mL 的誘導(dǎo)成熟的工程菌菌液，5 000 r/min 10 min，棄廢液，生理鹽水重懸洗滌菌體后用40 μL滅菌ddH2O充分混勻，加入 10 μL 5×Loading Buffer，煮沸3～5 min，以未導(dǎo)入目的基因的pET28a/BL21菌株做相同處理作陰性對照；各取10 μL上樣SDS-PAGE預(yù)制膠，電壓130 V電泳60 min，考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白條帶。將染色后的SDS-PAGE膠浸于緩沖液中，剪取NC 膜和濾紙一起放入緩沖液中平衡，濕轉(zhuǎn)，封閉，孵育一抗，孵育二抗，TMB顯色進(jìn)行Western Blot 鑒定[13-14]。

1.2.4 果膠裂解酶活力測定 用0.05 mol/L的Gly-NaOH的緩沖液(pH值9.0)配置聚半乳糖醛酸鈉底物溶液(5 mg/mL)。添加適量工程菌發(fā)酵液上清至1 mL底物溶液，搖勻后50 ℃酶解反應(yīng)10 min，加2 mL DNS，沸水浴顯色5 min；以滅活相同酶做陰性對照，測定OD520[15]。酶活力定義：底物1 min分解出1 μmol不飽和還原性物質(zhì)需要的酶量為1個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.2.5 PelG403生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站Expasy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析PelG403序列的基本理化性質(zhì)；SignalP-5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測其信號肽；用Pfam(http：//pfam.xfam.org/search/sequence)對PelG403的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

用生物信息學(xué)軟件Mega 7.0對來源于DCE-01菌株的PelG403氨基酸序列與其他微生物來源的PEL氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，隨后ClustalW軟件分別進(jìn)行雙序列比對；用計(jì)算機(jī)在線軟件PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測果膠裂解酶PelG403的二級結(jié)構(gòu)；利用瑞士生物信息學(xué)中心在線工具SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)對果膠裂解酶PelG403進(jìn)行同源建模，VMD進(jìn)行作圖分析，并利用Verify-3D對模型進(jìn)行評分[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pelG403基因擴(kuò)增

對引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因進(jìn)行檢驗(yàn)，圖2結(jié)果表明，其片段約為1 200 bp，這與預(yù)期的1 179 bp(pelG403目的基因片段與引入的酶切位點(diǎn)之和)相符。

2.2 菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取4個(gè)單菌落，進(jìn)行PCR鑒定。圖3結(jié)果表明：4個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物均有一特異條帶，其分子量(約1 200 bp)與預(yù)計(jì)大小(1 179 bp)基本一致。

2.3 PelG403表達(dá)效果分析

2.3.1 SDS-PAGE分析 將pelG403從重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-G403更換至pET28a載體后，收集誘導(dǎo)成熟的pET28a-G403/BL21菌體，對PelG403表達(dá)效果進(jìn)行SDS-PAGE分析。圖4結(jié)果表明，基因工程菌菌體樣品在35 ku上方有較清晰的專一蛋白條帶，但與預(yù)測帶有20個(gè)氨基酸的His標(biāo)簽的融合蛋白分子量(43.6 ku)相比略小。

Western Blot對菌體蛋白進(jìn)一步分析，圖4結(jié)果表明，在34～43 ku有明顯信號條帶。其分子量也比預(yù)期融合蛋白分子量43.6 ku略小。

2.3.2 酶活力檢測 取誘導(dǎo)12 h的pET28a-G403/BL21工程菌發(fā)酵液，測定其果膠裂解酶活力，表1結(jié)果表明，果膠裂解酶活力達(dá)335.8 U/mL，較pEASY-Blunt E1-G403/BL21提高了3.05倍。

表1 工程菌的果膠裂解酶活力Tab.1 Pectate lyase activity of engineering bacteria

2.4 果膠裂解酶PelG403生物信息學(xué)分析

2.4.1 基本性質(zhì)分析 對果膠裂解酶基因及其編碼產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：該果膠裂解酶基因pelG403序列全長為1 164 bp，編碼的果膠裂解酶PelG403含387個(gè)氨基酸，其N末端前35個(gè)氨基酸為信號肽序列，前體蛋白和成熟蛋白的分子量大小約為41.4，37.8 ku，其理論pI為7.64，半胱氨酸數(shù)量為4個(gè)，不穩(wěn)定性指數(shù)為27.42；該蛋白含有典型的右手β-螺旋結(jié)構(gòu)，屬于Pec lyase C家族。

2.4.2 親緣關(guān)系分析 將來源于DCE-01菌株的苧麻脫膠果膠裂解酶PelG403氨基酸序列與其他微生物來源的果膠裂解酶氨基酸序列進(jìn)行比較，并用Mega 7.0采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)，結(jié)果表明：PelG403與同樣來源于D.dadantii的果膠裂解酶(GenBank登錄號：ADN00346)的親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步用ClustalW軟件將PelG403與進(jìn)化樹中親緣關(guān)系較近的果膠裂解酶序列分別進(jìn)行比對，目的序列與D.dadantii(ADN00346)、D.chrysanthemi(PDB：2EWE)和Pectobacteriumversatile(ASN83858)相似性分別為95.9%，82.9%，82.0%。

2.4.3 二級結(jié)構(gòu)分析 利用PSIPRED生物信息工具分析PelG403的二級結(jié)構(gòu)(圖6)，結(jié)果表明：在PelG403中，螺旋占總蛋白的10.2%；折疊占總蛋白的46.0%；卷曲占比43.8%。

2.4.4 高級結(jié)構(gòu)分析 從PDB數(shù)據(jù)庫中選取了同源性最高的細(xì)菌來源PEL蛋白空間結(jié)構(gòu)(PDB：2EWE)為模板，對PelG403進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明(圖7)：PelG403主要由螺旋和卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果基本相符；且屬于典型的右手β-螺旋結(jié)構(gòu)，與Pfam結(jié)構(gòu)域分析一致，表明PelG403經(jīng)同源建模得到的蛋白三維結(jié)構(gòu)可信度高。

3 討論

果膠裂解酶參與生物脫膠時(shí)不需要果膠去酯化，可直接作用于甲酯化果膠，促進(jìn)半纖維素酶類和其他脫膠因子的有效滲透，其催化能力是苧麻生物脫膠的限速步驟[17-20]。因此，對PEL進(jìn)行高效表達(dá)有助于獲得大量優(yōu)良工業(yè)用果膠裂解酶，降低純化難度，有助于PEL脫膠功能與酶學(xué)特性的研究。

構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量受諸多因素影響，如密碼子偏好、啟動(dòng)子強(qiáng)度和表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)?？截悢?shù)等，這些因素對于蛋白的過量表達(dá)具有關(guān)鍵作用[21]。賀揚(yáng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，利用pGEX-2T 和pET28a 2種質(zhì)粒對IGF-2蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，雖然兩者均表達(dá)出具有生物學(xué)活性的IGF-2蛋白，但質(zhì)?？截悢?shù)更高的pET28a表達(dá)體系的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于pGEX-2T，本研究通過更換質(zhì)?？截悢?shù)更高的pET28a表達(dá)載體，使PelG403高效表達(dá)，其酶活力提高了3.05倍。這與前人的研究結(jié)果一致。

pET28a-G403/BL21表達(dá)產(chǎn)物的分子量比預(yù)測帶6×His標(biāo)簽的融合蛋白分子量(43.6 ku)略小，而PelG403預(yù)測信號肽為35個(gè)氨基酸，6×His標(biāo)簽有20個(gè)氨基酸，而表達(dá)產(chǎn)物的分子量正好與除去這55個(gè)氨基酸大小一致；推測可能由于目的蛋白分泌后，其攜帶His標(biāo)簽序列伴隨著信號肽序列一同被降解[23]，有待進(jìn)一步證實(shí)。

工業(yè)化脫膠加工時(shí)，需要相對高溫高堿的反應(yīng)環(huán)境，當(dāng)PEL相應(yīng)穩(wěn)定性不夠時(shí)，PEL的空間結(jié)構(gòu)容易被破壞，果膠裂解酶的活性大幅度降低，甚至完全失活[24]。本研究利用三維結(jié)構(gòu)建模、同源序列建樹、氨基酸序列比、結(jié)合重要結(jié)構(gòu)域?qū)ζr麻脫膠果膠裂解酶PelG403序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為該類酶的關(guān)鍵位點(diǎn)分析、分子改造及進(jìn)一步揭示PEL脫膠功能特性奠定了基礎(chǔ)。未來將進(jìn)一步分析確定PelG403的催化位點(diǎn)及功能域，并結(jié)合其關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高PelG403的比酶活和耐熱耐堿性，為苧麻脫膠加工的酶制劑產(chǎn)業(yè)提供理想材料。