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        OsSP1基因編輯和過(guò)表達(dá)對(duì)水稻生長(zhǎng)和干旱抗性的影響

        2021-11-01 07:04:00騰海艷
        華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:水稻

        騰海艷,徐 丹

        (1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西 宜春 336000;2.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院,江西 宜春 336000)

        葉綠體是綠色植物最重要的細(xì)胞器之一,涉及包括光合作用在內(nèi)的多條代謝途徑[1-3]。在成熟葉綠體的約3 000種蛋白質(zhì)中,僅100種左右由葉綠體自身基因編碼,其余均由核基因編碼,在細(xì)胞質(zhì)合成后,通過(guò)葉綠體外膜和內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體內(nèi)[4-5]。隨著葉綠體的分化發(fā)育和外界環(huán)境變化,葉綠體蛋白質(zhì)組也處于動(dòng)態(tài)的變化中[6-7],植物需根據(jù)內(nèi)外環(huán)境的變化對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)的輸入進(jìn)行調(diào)控。

        Ling等[8-12]的研究結(jié)果顯示,SP1(Suppressor of ppi1 locus1)蛋白是擬南芥(Arabidopsisthaliana)葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控的關(guān)鍵因子,該蛋白由sp1基因編碼,定位于葉綠體外膜,是一種泛肽E3連接酶[12],可催化葉綠體外膜上的TOC33、TOC75、TOC159(Translocon of the outer membrane of chloroplasts)等多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生泛肽化,再在SP2(Suppressor of ppi1 locus2)蛋白、CDC48(Cell division cycle 48)蛋白以及胞質(zhì)中的泛肽-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS)的參與下,將泛肽化蛋白降解清除[11]。通過(guò)控制葉綠體的蛋白質(zhì)輸入,sp1基因的表達(dá)可影響葉綠體內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生水平,從而影響植物的逆境響應(yīng)能力[9,11]。

        盡管sp1基因?qū)χ参锏娜~綠體蛋白輸入和抗逆性具有重要影響[8-9],迄今為止,對(duì)該基因的研究主要是以擬南芥為材料展開(kāi)的[8-12]。葉綠體的功能與植物的光合效率直接相關(guān),對(duì)于農(nóng)作物,葉綠體蛋白輸入調(diào)控直接影響到作物的產(chǎn)量和抗逆性。水稻是全球范圍內(nèi)最重要的糧食作物之一,也是重要的模式植物,研究水稻的sp1同源基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育和脅迫抗性的影響,對(duì)闡明該基因的作用機(jī)制具有重要意義,也可以為農(nóng)作物品種的研發(fā)和選育提供參考依據(jù)[13]。

        筆者在前期工作中[14],采用生物信息學(xué)手段和分子生物學(xué)技術(shù),確定并克隆了sp1基因在水稻中的同源序列OsSP1(Os07g0647800),該基因的編碼產(chǎn)物含343個(gè)氨基酸殘基,與擬南芥SP1蛋白氨基酸殘基數(shù)相同,二者序列相似度為71.18%,且信號(hào)肽的位置和序列也與擬南芥SP1蛋白相同,亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白確實(shí)定位于水稻葉綠體。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示OsSP1在葉片中表達(dá)水平高于葉鞘和根,并且具有明顯的干旱響應(yīng)特性。這些結(jié)果顯示了OsSP1基因在結(jié)構(gòu)和定位上與擬南芥sp1基因的一致性,但OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育和脅迫耐受性的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

        CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便、高效的基因編輯工具,自開(kāi)始報(bào)道以來(lái)[15-16],在幾年的時(shí)間里得到了快速發(fā)展,技術(shù)也日臻成熟完善[17-18],在水稻等多種生物的基因功能研究中得到了廣泛應(yīng)用[19-21]。本研究利用植物基因過(guò)表達(dá)技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),分別對(duì)水稻OsSP1基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)和基因編輯,通過(guò)對(duì)獲得的過(guò)表達(dá)株系和基因編輯株系進(jìn)行表型對(duì)比、葉綠素含量測(cè)定和ROS水平測(cè)定,確定OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育的影響,通過(guò)對(duì)純合過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行干旱脅迫處理,確定OsSP1基因?qū)λ久{迫耐受性的影響。

        1 材料和方法

        1.1 植物材料及栽培條件

        本研究以水稻品種中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體,轉(zhuǎn)基因材料種植于苗圃溫網(wǎng)室,常規(guī)種植和管理。

        1.2 CRISPR/Cas9基因編輯靶位點(diǎn)的選擇和載體構(gòu)建

        在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)進(jìn)行OsSP1基因的編碼序列分析,根據(jù)外顯子的位置選擇2個(gè)20 bp的靶點(diǎn)序列,分別稱為靶序列1(target 1)和靶序列2(target 2)。通過(guò)NCBI的Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分析,確保2個(gè)靶位點(diǎn)的特異性。

        基因編輯載體的構(gòu)建方法參照Ma等[17]的報(bào)道,以pYL-OsU-gRNA質(zhì)粒為模板,在20 μL的KOD neo反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)fp1-F和gRNA-R引物各1 μL(10 μmol/L),target1-F、target1-R或target2-F、target2-R引物各0.5 μL(10 μmol/L),擴(kuò)增出pOsU-target片段和target-gRNA片段。取擴(kuò)增產(chǎn)物0.1 μL作為模板,加入每個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的U6a-F、g1-R或U6b-F、g2-R引物進(jìn)行第2輪overlapping PCR,分別擴(kuò)增出pOsU-target1-gRNA片段和pOsU-target2-gRNA片段。PCR反應(yīng)條件:94 ℃,15 s,58 ℃,15 s,68 ℃,20 s,28個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收。取每個(gè)靶點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物約15 ng,與酶切后的CRISPR/Cas9載體混合,將sgRNA表達(dá)框連入Cas9載體,連接體系總體積為20 μL(Buffer 2.0 μL,BsaⅠ酶切過(guò)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒60 ng,T4DNA連接酶1 μL,2個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物共30 ng,ddH2O補(bǔ)至20 μL),連接條件為:37 ℃,5 min;10 ℃,5 min,20 ℃,5 min,10個(gè)循環(huán);37 ℃,5 min。PCR引物見(jiàn)表1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株,經(jīng)菌液PCR和核酸序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

        1.3 OsSP1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

        以筆者在前期工作中構(gòu)建的帶有OsSP1編碼序列的質(zhì)粒[14]作為模板,用帶有酶切位點(diǎn)的引物sp1-SpeⅠ-F和sp1-HindⅢ-R(表1),擴(kuò)增OsSP1基因從起始密碼子ATG至終止密碼子TGA的全長(zhǎng)序列,產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離和天根DNA回收試劑盒回收,送上海生工測(cè)序確定為正確序列后,采用酶切、連接方法,將該序列連入到過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒的35S啟動(dòng)子和nos終止子之間,構(gòu)建完整的p35S-OsSP1-nos表達(dá)框。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株,經(jīng)菌液PCR和核酸序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

        表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

        1.4 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

        參照Ozawa[22]的方法,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織,通過(guò)潮霉素篩選,分別獲得T0OsSP1基因編輯植株和過(guò)表達(dá)植株。

        1.5 基因編輯植株靶位點(diǎn)序列的檢測(cè)

        T0基因編輯植株采用氫氧化鈉法[23]提取葉片DNA作為模板,設(shè)計(jì)2個(gè)目的序列的檢測(cè)引物sp1t1-F、sp1t1-R和sp1t2-F、sp1t2-R(表1),擴(kuò)增目的片段后,PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析基因編輯植株中目的基因的突變情況。

        1.6 過(guò)表達(dá)植株純合后代篩選和Real time PCR檢測(cè)

        T0過(guò)表達(dá)植株采用氫氧化鈉法提取葉片DNA作為模板,通過(guò)hpt-F和hpt-R引物進(jìn)行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)的擴(kuò)增篩選出陽(yáng)性株系,種植后獲得T1種子,將每個(gè)株系分單株收獲的T1種子100顆發(fā)芽后,用含10 mg/L潮霉素的木村B營(yíng)養(yǎng)液篩選7 d,統(tǒng)計(jì)正常生長(zhǎng)與死亡植株的比例,存活與死亡植株比例符合3∶1的即為目的基因單拷貝插入株系,種植后分單株收獲T2種子,按T1篩選方法,用潮霉素篩選7 d,所有植株均正常生長(zhǎng)的株系即為單拷貝純合子株系[24]。

        野生型和純合子株系的葉片樣品各4片,分別混合、剪碎后經(jīng)Magen試劑盒提取總RNA,Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,cDNA產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍后作為模板,以O(shè)sActin1(Os03g07181000)作為內(nèi)參,使用引物sp1-1210-F、sp1-1379-R、OsActin1-F和OsActin1-R(表1)進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增,數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法[25-26],Excel軟件和Sigma Plot軟件進(jìn)行分析和作圖。Real time PCR反應(yīng)條件:95 ℃,3 min;95 ℃,15 s,60 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。

        1.7 葉綠素含量測(cè)定

        葉綠素含量測(cè)定參照李合生[27]的方法,對(duì)分蘗期植株,由上至下取第2片葉片,每個(gè)株系平行取樣3份,剪去葉尖和葉基部后,剪成細(xì)絲,混勻,稱取0.01 g,用2 mL葉綠素提取液(V丙酮∶V酒精∶V水=4.5∶4.5∶1.0)萃取出葉綠素,提取液用分光光度計(jì)比色,分別測(cè)定663(葉綠素a吸收峰),645 nm(葉綠素b吸收峰)波長(zhǎng)的OD值,按公式:Chla(葉綠素a)=13.95×OD663-6.88×OD645;Chlb(葉綠素b)=24.96×OD645-7.32×OD663,分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度(mg/L),二者之和為葉綠素總濃度,再根據(jù)下式進(jìn)一步求出葉片中葉綠素的總含量:葉綠素總含量(mg/g鮮質(zhì)量)=(葉綠素總濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮質(zhì)量(g)。數(shù)據(jù)處理采用t-檢驗(yàn),Excel軟件和Sigma Plot軟件進(jìn)行分析和作圖。

        1.8 DAB染色

        DAB染色參照Thordal-Christensen等[28]的方法,對(duì)分蘗期植株,選擇晴朗的天氣于清晨取樣,每株由上至下取第2,3,4片葉片,迅速插入1 mg/L的DAB(二氨基聯(lián)苯胺,3′3-diaminobenzidine,pH值3.8)溶液中,自然光下反應(yīng)約3 h,待葉片出現(xiàn)大量暗棕色條紋后,終止反應(yīng),用無(wú)水乙醇在80 ℃水浴中脫色1 h以上至葉綠素脫盡。

        1.9 干旱處理

        純合過(guò)表達(dá)株系OE3-1-2、OE4-1-6及野生型種子發(fā)芽后,點(diǎn)播于水稻種植用土壤中生長(zhǎng)至一葉一心期,選擇生長(zhǎng)一致的幼苗栽種于干旱處理用橡膠桶(桶高:12 cm,桶口直徑:25 cm,桶底直徑:20 cm,土壤厚度:4 cm),每桶野生型和轉(zhuǎn)基因植株各25株。生長(zhǎng)至三葉一心期的植株停止供水,進(jìn)行干旱處理約7 d,至葉片全部干枯后,恢復(fù)供水,繼續(xù)生長(zhǎng)7 d,觀察恢復(fù)狀況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 CRISPR/Cas9基因編輯靶位點(diǎn)的選擇和載體構(gòu)建

        通過(guò)Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站對(duì)OsSP1編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示,該基因編碼區(qū)含有11個(gè)短序列外顯子,分別在第4和第7外顯子上選擇靶序列1和靶序列2作為基因編輯靶位點(diǎn)(圖1-A),經(jīng)Blast分析,確定2個(gè)靶序列均具有高特異性,不會(huì)對(duì)其他同源基因造成影響。構(gòu)建成功的CRISPR/Cas9基因編輯載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-B。

        經(jīng)目的基因擴(kuò)增、限制性酶切和T4DNA連接酶連接,構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-C。

        2.2 T0-基因編輯基因植株的突變類型

        通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織,經(jīng)潮霉素篩選,共獲得9個(gè)具有潮霉素抗性的陽(yáng)性T0基因編輯株系。經(jīng)葉片DNA提取和檢測(cè)引物擴(kuò)增目的片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,結(jié)果顯示(表2),9個(gè)株系中,有2個(gè)株系突變發(fā)生于靶序列1,純合突變和雜合突變各1個(gè),純合突變系sp1-1的突變方式為A刪除,該位點(diǎn)為基因讀碼框的第291個(gè)核苷酸。有6個(gè)株系突變發(fā)生于靶序列2,其中雙等位突變5個(gè),雜合突變1個(gè),突變方式包括單核苷酸的插入、刪除,以及2,3,180 bp的刪除。有1個(gè)株系sp1-9的1,22個(gè)靶序列同時(shí)發(fā)生了突變,造成1個(gè)612 bp的大片段刪除和1個(gè)5 bp刪除,但只有一個(gè)等位基因發(fā)生了突變,為雜合突變。

        表2 T0基因編輯株系中OsSP1基因的突變類型Tab.2 Mutation type of OsSP1 gene in T0 gene-edited lines

        2.3 過(guò)表達(dá)植株中的純合子篩選和表達(dá)分析

        通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得的T0過(guò)表達(dá)株系,經(jīng)葉片DNA提取和hpt序列擴(kuò)增,共獲得12個(gè)陽(yáng)性株系(圖2-A),種植后獲得的T1和T2種子,發(fā)芽后經(jīng)潮霉素篩選獲得單拷貝插入株系。最終獲得3個(gè)單拷貝純合子株系命名為OE2-2-1、OE3-1-4和OE4-3-8(分別來(lái)自T0的株系2、株系3和株系4)。以水稻OsActin1作為內(nèi)參,進(jìn)行Real time PCR分析的結(jié)果顯示(圖2-B),目的基因OsSP1在3個(gè)純合過(guò)表達(dá)株系中的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于野生型植株,分別為野生型植株中的3.5,4.6,5.4倍。

        2.4 基因編輯和過(guò)表達(dá)植株的表型

        純合突變、雙等位突變和雜合突變的T0和T1OsSP1基因編輯植株均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)遲滯表型。植株生長(zhǎng)緩慢,矮小,葉片黃化,從幼苗起即出現(xiàn)葉片早衰、早枯現(xiàn)象,不分蘗,老葉較快進(jìn)入衰老、死亡狀態(tài),植株從上至下始終只保留3~4片未干枯葉片(圖3)。T0植株在灌漿期后,葉片衰老進(jìn)一步加快,在種子進(jìn)入臘熟期前葉片即全部干枯(圖3-A),結(jié)實(shí)率低,每株結(jié)實(shí)約10顆種子,且種子不飽滿(圖3-A、B)。T1植株的生長(zhǎng)表型與T0相同(圖3-C、D),但各種突變類型的T1株系分別在春、夏季種植后均未抽穗結(jié)實(shí)(圖3-E)。由于各類突變的基因編輯植株結(jié)實(shí)數(shù)均較少,未能獲得足夠種子進(jìn)行大規(guī)模種植和農(nóng)學(xué)表型統(tǒng)計(jì)。

        純合過(guò)表達(dá)植株生長(zhǎng)良好,各時(shí)期生長(zhǎng)狀態(tài)和結(jié)實(shí)情況與野生型無(wú)明顯差異(圖3-D、E)。將OE2-2-1、OE3-1-4和OE4-3-8土培種植后,每個(gè)株系取20株進(jìn)行株高、劍葉長(zhǎng)、分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,純合過(guò)表達(dá)植株的農(nóng)學(xué)性狀與野生型植株均無(wú)顯著差異(圖4)。

        2.5 基因編輯和過(guò)表達(dá)植株的葉綠素含量和H2O2水平

        基因編輯植株具有明顯的葉片黃化表型,為確定植株的葉綠素的變化水平,對(duì)分蘗期的純合過(guò)表達(dá)株系OE3-1-4、OE4-3-8和純合突變株系sp1-1-2及雙等位突變株系sp1-5-1進(jìn)行了葉綠素含量分析。結(jié)果顯示,2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的葉綠素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))與野生型植株相比無(wú)顯著變化,而2個(gè)基因編輯株系的葉綠素含量均出現(xiàn)顯著或極顯著下降,與野生型植株比較,分別具有顯著差異和極顯著差異(圖5-A)。

        選取分蘗期的過(guò)表達(dá)植株OE4-3-8和基因編輯植株sp1-1-2,每株從上至下取成熟程度不同的第2,3,4片葉片,采用DAB染色法進(jìn)行了葉片H2O2檢測(cè),結(jié)果顯示,對(duì)比每類植株自身的第2,3,4片葉片,H2O2水平并無(wú)明顯差別;對(duì)比不同類型植株的相同序號(hào)葉片,H2O2含量也未見(jiàn)明顯差異(圖5-B)。

        2.6 過(guò)表達(dá)植株的干旱耐受性

        對(duì)三葉一心期的純合過(guò)表達(dá)植株OE3-1-4和OE4-3-8進(jìn)行重度干旱處理和復(fù)水,復(fù)水7 d后觀察恢復(fù)狀態(tài),結(jié)果顯示,在重度干旱處理和恢復(fù)供水后,2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的恢復(fù)能力與野生型植株相比并無(wú)明顯差異(圖6),干旱脅迫抗性未見(jiàn)增強(qiáng)。

        由于基因編輯植株在正常條件下即已出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)發(fā)育遲滯,且產(chǎn)生的種子量較少,發(fā)芽力差,未能對(duì)OsSP1基因編輯植株進(jìn)行干旱處理和耐受性分析。

        3 結(jié)論與討論

        在擬南芥中,sp1基因是葉綠體蛋白輸入的控制基因,并通過(guò)該途徑控制葉綠體內(nèi)ROS的產(chǎn)生,進(jìn)而影響植物的逆境響應(yīng)能力[9,11]。葉綠體的功能與植物的光合效率直接相關(guān),對(duì)于水稻等農(nóng)作物,葉綠體蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性將直接影響到作物的產(chǎn)量和抗逆性[29]。為確定水稻OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及脅迫抗性的影響,本研究通過(guò)基因過(guò)表達(dá)技術(shù)創(chuàng)建了OsSP1基因過(guò)表達(dá)植株,通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在OsSP1基因編碼區(qū)選擇了雙靶點(diǎn)進(jìn)行編輯,獲得了基因編輯植株。水稻SP1蛋白與擬南芥SP1蛋白高度同源[14],屬于泛肽E3連接酶家族成員[12]。靶序列1和靶序列2的突變分別會(huì)造成SP1蛋白從第97個(gè)或第199個(gè)氨基酸(或其附近)開(kāi)始發(fā)生移碼突變或片段缺失,這2個(gè)位點(diǎn)均位于蛋白質(zhì)分子中2個(gè)跨膜區(qū)之間的肽段上[14],發(fā)生移碼突變后,其下游結(jié)構(gòu),包括第220-250位氨基酸殘基區(qū)的跨膜序列,以及羧基端非跨膜肽段中的RING(Really interesting new gene)保守結(jié)構(gòu)域,都將受到嚴(yán)重影響,造成SP1不能與泛肽系統(tǒng)中的泛肽結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,E2)發(fā)生識(shí)別[11],從而失去既定功能。

        在正常生長(zhǎng)條件下,擬南芥sp1突變體的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型植株并無(wú)差別[9]。與擬南芥不同,水稻OsSP1基因編輯植株在正常生長(zhǎng)條件下即表現(xiàn)出葉綠素水平顯著或極顯著下降、早衰、不分蘗、低結(jié)實(shí)率或不結(jié)實(shí)等表型。由于氧化脅迫是引發(fā)葉片早衰的重要因素[30-32],并且sp1在擬南芥中的作用機(jī)制與氧化脅迫有關(guān)[9],本研究也對(duì)水稻過(guò)表達(dá)和基因編輯植株進(jìn)行了H2O2檢測(cè),但過(guò)表達(dá)和基因編輯植株中H2O2的生成水平相比野生型植株均無(wú)明顯變化,說(shuō)明在OsSP1基因編輯植株中,早衰等表型可能并不是氧化脅迫導(dǎo)致。根據(jù)OsSP1基因編輯植株的生長(zhǎng)狀況和顯著或極顯著降低的葉綠素水平,可確定OsSP1基因突變引發(fā)了葉綠體蛋白質(zhì)組整體水平的變化和植物體的全面代謝失調(diào)[8],從而造成了矮小、早衰、減產(chǎn)或失去育性等嚴(yán)重缺陷,而不只局限于與光反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的輸入失調(diào)和氧化脅迫。根據(jù)Pan等[33]的報(bào)道,擬南芥中存在sp1基因的同源基因,當(dāng)sp1基因突變后,其部分功能可能由同源基因替代,因此,擬南芥sp1突變體在正常條件下沒(méi)有出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)缺陷。根據(jù)水稻OsSP1基因編輯植株的表型,結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果[14],推測(cè)水稻中沒(méi)有類似的同源基因補(bǔ)充OsSP1突變后缺失的功能,因此,OsSP1突變直接干擾了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育,并且其影響程度遠(yuǎn)超過(guò)sp1突變對(duì)擬南芥的影響。

        擬南芥的sp1過(guò)表達(dá)植株在正常生長(zhǎng)條件下與野生型植株表型一致,但對(duì)滲透脅迫和鹽脅迫的抗性明顯增強(qiáng)[9]。水稻的OsSP1過(guò)表達(dá)植株在正常條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)和結(jié)實(shí)情況與野生型植株也無(wú)明顯差異,但與擬南芥不同的是,在干旱處理后,OsSP1過(guò)表達(dá)植株的抗性也未見(jiàn)明顯變化,表明在水稻中過(guò)量表達(dá)OsSP1后,對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和干旱抗性均無(wú)明顯的促進(jìn)作用,也無(wú)明顯的干擾。

        OsSP1基因編輯植株和過(guò)表達(dá)植株的表型和生理生化指標(biāo)顯示了OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控作用,提高基因表達(dá)水平對(duì)水稻的生長(zhǎng)和干旱抗性無(wú)明顯影響,但基因突變嚴(yán)重影響水稻植株的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí),其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘。

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