騰海艷，徐 丹

(1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000；2.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

葉綠體是綠色植物最重要的細(xì)胞器之一，涉及包括光合作用在內(nèi)的多條代謝途徑[1-3]。在成熟葉綠體的約3 000種蛋白質(zhì)中，僅100種左右由葉綠體自身基因編碼，其余均由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)合成后，通過(guò)葉綠體外膜和內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體內(nèi)[4-5]。隨著葉綠體的分化發(fā)育和外界環(huán)境變化，葉綠體蛋白質(zhì)組也處于動(dòng)態(tài)的變化中[6-7]，植物需根據(jù)內(nèi)外環(huán)境的變化對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)的輸入進(jìn)行調(diào)控。

Ling等[8-12]的研究結(jié)果顯示，SP1(Suppressor of ppi1 locus1)蛋白是擬南芥(Arabidopsisthaliana)葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控的關(guān)鍵因子，該蛋白由sp1基因編碼，定位于葉綠體外膜，是一種泛肽E3連接酶[12]，可催化葉綠體外膜上的TOC33、TOC75、TOC159(Translocon of the outer membrane of chloroplasts)等多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生泛肽化，再在SP2(Suppressor of ppi1 locus2)蛋白、CDC48(Cell division cycle 48)蛋白以及胞質(zhì)中的泛肽-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)的參與下，將泛肽化蛋白降解清除[11]。通過(guò)控制葉綠體的蛋白質(zhì)輸入，sp1基因的表達(dá)可影響葉綠體內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生水平，從而影響植物的逆境響應(yīng)能力[9，11]。

盡管sp1基因?qū)χ参锏娜~綠體蛋白輸入和抗逆性具有重要影響[8-9]，迄今為止，對(duì)該基因的研究主要是以擬南芥為材料展開(kāi)的[8-12]。葉綠體的功能與植物的光合效率直接相關(guān)，對(duì)于農(nóng)作物，葉綠體蛋白輸入調(diào)控直接影響到作物的產(chǎn)量和抗逆性。水稻是全球范圍內(nèi)最重要的糧食作物之一，也是重要的模式植物，研究水稻的sp1同源基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育和脅迫抗性的影響，對(duì)闡明該基因的作用機(jī)制具有重要意義，也可以為農(nóng)作物品種的研發(fā)和選育提供參考依據(jù)[13]。

筆者在前期工作中[14]，采用生物信息學(xué)手段和分子生物學(xué)技術(shù)，確定并克隆了sp1基因在水稻中的同源序列OsSP1(Os07g0647800)，該基因的編碼產(chǎn)物含343個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥SP1蛋白氨基酸殘基數(shù)相同，二者序列相似度為71.18%，且信號(hào)肽的位置和序列也與擬南芥SP1蛋白相同，亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白確實(shí)定位于水稻葉綠體。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示OsSP1在葉片中表達(dá)水平高于葉鞘和根，并且具有明顯的干旱響應(yīng)特性。這些結(jié)果顯示了OsSP1基因在結(jié)構(gòu)和定位上與擬南芥sp1基因的一致性，但OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育和脅迫耐受性的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便、高效的基因編輯工具，自開(kāi)始報(bào)道以來(lái)[15-16]，在幾年的時(shí)間里得到了快速發(fā)展，技術(shù)也日臻成熟完善[17-18]，在水稻等多種生物的基因功能研究中得到了廣泛應(yīng)用[19-21]。本研究利用植物基因過(guò)表達(dá)技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別對(duì)水稻OsSP1基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)和基因編輯，通過(guò)對(duì)獲得的過(guò)表達(dá)株系和基因編輯株系進(jìn)行表型對(duì)比、葉綠素含量測(cè)定和ROS水平測(cè)定，確定OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育的影響，通過(guò)對(duì)純合過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行干旱脅迫處理，確定OsSP1基因?qū)λ久{迫耐受性的影響。

1 材料和方法

1.1 植物材料及栽培條件

本研究以水稻品種中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體，轉(zhuǎn)基因材料種植于苗圃溫網(wǎng)室，常規(guī)種植和管理。

1.2 CRISPR/Cas9基因編輯靶位點(diǎn)的選擇和載體構(gòu)建

在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)進(jìn)行OsSP1基因的編碼序列分析，根據(jù)外顯子的位置選擇2個(gè)20 bp的靶點(diǎn)序列，分別稱為靶序列1(target 1)和靶序列2(target 2)。通過(guò)NCBI的Blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分析，確保2個(gè)靶位點(diǎn)的特異性。

基因編輯載體的構(gòu)建方法參照Ma等[17]的報(bào)道，以pYL-OsU-gRNA質(zhì)粒為模板，在20 μL的KOD neo反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)fp1-F和gRNA-R引物各1 μL(10 μmol/L)，target1-F、target1-R或target2-F、target2-R引物各0.5 μL(10 μmol/L)，擴(kuò)增出pOsU-target片段和target-gRNA片段。取擴(kuò)增產(chǎn)物0.1 μL作為模板，加入每個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的U6a-F、g1-R或U6b-F、g2-R引物進(jìn)行第2輪overlapping PCR，分別擴(kuò)增出pOsU-target1-gRNA片段和pOsU-target2-gRNA片段。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，15 s，58 ℃，15 s，68 ℃，20 s,28個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收。取每個(gè)靶點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物約15 ng，與酶切后的CRISPR/Cas9載體混合，將sgRNA表達(dá)框連入Cas9載體，連接體系總體積為20 μL(Buffer 2.0 μL，BsaⅠ酶切過(guò)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒60 ng，T4DNA連接酶1 μL，2個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物共30 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL)，連接條件為：37 ℃，5 min；10 ℃，5 min，20 ℃，5 min，10個(gè)循環(huán)；37 ℃，5 min。PCR引物見(jiàn)表1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，經(jīng)菌液PCR和核酸序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.3 OsSP1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

以筆者在前期工作中構(gòu)建的帶有OsSP1編碼序列的質(zhì)粒[14]作為模板，用帶有酶切位點(diǎn)的引物sp1-SpeⅠ-F和sp1-HindⅢ-R(表1)，擴(kuò)增OsSP1基因從起始密碼子ATG至終止密碼子TGA的全長(zhǎng)序列，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離和天根DNA回收試劑盒回收，送上海生工測(cè)序確定為正確序列后，采用酶切、連接方法，將該序列連入到過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒的35S啟動(dòng)子和nos終止子之間，構(gòu)建完整的p35S-OsSP1-nos表達(dá)框。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，經(jīng)菌液PCR和核酸序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

1.4 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

參照Ozawa[22]的方法，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，通過(guò)潮霉素篩選，分別獲得T0OsSP1基因編輯植株和過(guò)表達(dá)植株。

1.5 基因編輯植株靶位點(diǎn)序列的檢測(cè)

T0基因編輯植株采用氫氧化鈉法[23]提取葉片DNA作為模板，設(shè)計(jì)2個(gè)目的序列的檢測(cè)引物sp1t1-F、sp1t1-R和sp1t2-F、sp1t2-R(表1)，擴(kuò)增目的片段后，PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析基因編輯植株中目的基因的突變情況。

1.6 過(guò)表達(dá)植株純合后代篩選和Real time PCR檢測(cè)

T0過(guò)表達(dá)植株采用氫氧化鈉法提取葉片DNA作為模板，通過(guò)hpt-F和hpt-R引物進(jìn)行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)的擴(kuò)增篩選出陽(yáng)性株系，種植后獲得T1種子，將每個(gè)株系分單株收獲的T1種子100顆發(fā)芽后，用含10 mg/L潮霉素的木村B營(yíng)養(yǎng)液篩選7 d，統(tǒng)計(jì)正常生長(zhǎng)與死亡植株的比例，存活與死亡植株比例符合3∶1的即為目的基因單拷貝插入株系，種植后分單株收獲T2種子，按T1篩選方法，用潮霉素篩選7 d，所有植株均正常生長(zhǎng)的株系即為單拷貝純合子株系[24]。

野生型和純合子株系的葉片樣品各4片，分別混合、剪碎后經(jīng)Magen試劑盒提取總RNA，Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍后作為模板，以O(shè)sActin1(Os03g07181000)作為內(nèi)參，使用引物sp1-1210-F、sp1-1379-R、OsActin1-F和OsActin1-R(表1)進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增，數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法[25-26]，Excel軟件和Sigma Plot軟件進(jìn)行分析和作圖。Real time PCR反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.7 葉綠素含量測(cè)定

葉綠素含量測(cè)定參照李合生[27]的方法，對(duì)分蘗期植株，由上至下取第2片葉片，每個(gè)株系平行取樣3份，剪去葉尖和葉基部后，剪成細(xì)絲，混勻，稱取0.01 g，用2 mL葉綠素提取液(V丙酮∶V酒精∶V水=4.5∶4.5∶1.0)萃取出葉綠素，提取液用分光光度計(jì)比色，分別測(cè)定663(葉綠素a吸收峰),645 nm(葉綠素b吸收峰)波長(zhǎng)的OD值，按公式：Chla(葉綠素a)=13.95×OD663-6.88×OD645；Chlb(葉綠素b)=24.96×OD645-7.32×OD663，分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度(mg/L)，二者之和為葉綠素總濃度，再根據(jù)下式進(jìn)一步求出葉片中葉綠素的總含量：葉綠素總含量(mg/g鮮質(zhì)量)=(葉綠素總濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮質(zhì)量(g)。數(shù)據(jù)處理采用t-檢驗(yàn)，Excel軟件和Sigma Plot軟件進(jìn)行分析和作圖。

1.8 DAB染色

DAB染色參照Thordal-Christensen等[28]的方法，對(duì)分蘗期植株，選擇晴朗的天氣于清晨取樣，每株由上至下取第2，3，4片葉片，迅速插入1 mg/L的DAB(二氨基聯(lián)苯胺，3′3-diaminobenzidine，pH值3.8)溶液中，自然光下反應(yīng)約3 h，待葉片出現(xiàn)大量暗棕色條紋后，終止反應(yīng)，用無(wú)水乙醇在80 ℃水浴中脫色1 h以上至葉綠素脫盡。

1.9 干旱處理

純合過(guò)表達(dá)株系OE3-1-2、OE4-1-6及野生型種子發(fā)芽后，點(diǎn)播于水稻種植用土壤中生長(zhǎng)至一葉一心期，選擇生長(zhǎng)一致的幼苗栽種于干旱處理用橡膠桶(桶高：12 cm，桶口直徑：25 cm，桶底直徑：20 cm，土壤厚度：4 cm)，每桶野生型和轉(zhuǎn)基因植株各25株。生長(zhǎng)至三葉一心期的植株停止供水，進(jìn)行干旱處理約7 d，至葉片全部干枯后，恢復(fù)供水，繼續(xù)生長(zhǎng)7 d，觀察恢復(fù)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9基因編輯靶位點(diǎn)的選擇和載體構(gòu)建

通過(guò)Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站對(duì)OsSP1編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示，該基因編碼區(qū)含有11個(gè)短序列外顯子，分別在第4和第7外顯子上選擇靶序列1和靶序列2作為基因編輯靶位點(diǎn)(圖1-A)，經(jīng)Blast分析，確定2個(gè)靶序列均具有高特異性，不會(huì)對(duì)其他同源基因造成影響。構(gòu)建成功的CRISPR/Cas9基因編輯載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-B。

經(jīng)目的基因擴(kuò)增、限制性酶切和T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-C。

2.2 T0-基因編輯基因植株的突變類型

通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選，共獲得9個(gè)具有潮霉素抗性的陽(yáng)性T0基因編輯株系。經(jīng)葉片DNA提取和檢測(cè)引物擴(kuò)增目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果顯示(表2)，9個(gè)株系中，有2個(gè)株系突變發(fā)生于靶序列1，純合突變和雜合突變各1個(gè)，純合突變系sp1-1的突變方式為A刪除，該位點(diǎn)為基因讀碼框的第291個(gè)核苷酸。有6個(gè)株系突變發(fā)生于靶序列2，其中雙等位突變5個(gè)，雜合突變1個(gè)，突變方式包括單核苷酸的插入、刪除，以及2，3，180 bp的刪除。有1個(gè)株系sp1-9的1，22個(gè)靶序列同時(shí)發(fā)生了突變，造成1個(gè)612 bp的大片段刪除和1個(gè)5 bp刪除，但只有一個(gè)等位基因發(fā)生了突變，為雜合突變。

表2 T0基因編輯株系中OsSP1基因的突變類型Tab.2 Mutation type of OsSP1 gene in T0 gene-edited lines

2.3 過(guò)表達(dá)植株中的純合子篩選和表達(dá)分析

通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得的T0過(guò)表達(dá)株系，經(jīng)葉片DNA提取和hpt序列擴(kuò)增，共獲得12個(gè)陽(yáng)性株系(圖2-A)，種植后獲得的T1和T2種子，發(fā)芽后經(jīng)潮霉素篩選獲得單拷貝插入株系。最終獲得3個(gè)單拷貝純合子株系命名為OE2-2-1、OE3-1-4和OE4-3-8(分別來(lái)自T0的株系2、株系3和株系4)。以水稻OsActin1作為內(nèi)參，進(jìn)行Real time PCR分析的結(jié)果顯示(圖2-B)，目的基因OsSP1在3個(gè)純合過(guò)表達(dá)株系中的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于野生型植株，分別為野生型植株中的3.5，4.6，5.4倍。

2.4 基因編輯和過(guò)表達(dá)植株的表型

純合突變、雙等位突變和雜合突變的T0和T1OsSP1基因編輯植株均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)遲滯表型。植株生長(zhǎng)緩慢，矮小，葉片黃化，從幼苗起即出現(xiàn)葉片早衰、早枯現(xiàn)象，不分蘗，老葉較快進(jìn)入衰老、死亡狀態(tài)，植株從上至下始終只保留3～4片未干枯葉片(圖3)。T0植株在灌漿期后，葉片衰老進(jìn)一步加快，在種子進(jìn)入臘熟期前葉片即全部干枯(圖3-A)，結(jié)實(shí)率低，每株結(jié)實(shí)約10顆種子，且種子不飽滿(圖3-A、B)。T1植株的生長(zhǎng)表型與T0相同(圖3-C、D)，但各種突變類型的T1株系分別在春、夏季種植后均未抽穗結(jié)實(shí)(圖3-E)。由于各類突變的基因編輯植株結(jié)實(shí)數(shù)均較少，未能獲得足夠種子進(jìn)行大規(guī)模種植和農(nóng)學(xué)表型統(tǒng)計(jì)。

純合過(guò)表達(dá)植株生長(zhǎng)良好，各時(shí)期生長(zhǎng)狀態(tài)和結(jié)實(shí)情況與野生型無(wú)明顯差異(圖3-D、E)。將OE2-2-1、OE3-1-4和OE4-3-8土培種植后，每個(gè)株系取20株進(jìn)行株高、劍葉長(zhǎng)、分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，純合過(guò)表達(dá)植株的農(nóng)學(xué)性狀與野生型植株均無(wú)顯著差異(圖4)。

2.5 基因編輯和過(guò)表達(dá)植株的葉綠素含量和H2O2水平

基因編輯植株具有明顯的葉片黃化表型，為確定植株的葉綠素的變化水平，對(duì)分蘗期的純合過(guò)表達(dá)株系OE3-1-4、OE4-3-8和純合突變株系sp1-1-2及雙等位突變株系sp1-5-1進(jìn)行了葉綠素含量分析。結(jié)果顯示，2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的葉綠素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))與野生型植株相比無(wú)顯著變化，而2個(gè)基因編輯株系的葉綠素含量均出現(xiàn)顯著或極顯著下降，與野生型植株比較，分別具有顯著差異和極顯著差異(圖5-A)。

選取分蘗期的過(guò)表達(dá)植株OE4-3-8和基因編輯植株sp1-1-2，每株從上至下取成熟程度不同的第2，3，4片葉片，采用DAB染色法進(jìn)行了葉片H2O2檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)比每類植株自身的第2，3，4片葉片，H2O2水平并無(wú)明顯差別；對(duì)比不同類型植株的相同序號(hào)葉片，H2O2含量也未見(jiàn)明顯差異(圖5-B)。

2.6 過(guò)表達(dá)植株的干旱耐受性

對(duì)三葉一心期的純合過(guò)表達(dá)植株OE3-1-4和OE4-3-8進(jìn)行重度干旱處理和復(fù)水，復(fù)水7 d后觀察恢復(fù)狀態(tài)，結(jié)果顯示，在重度干旱處理和恢復(fù)供水后，2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的恢復(fù)能力與野生型植株相比并無(wú)明顯差異(圖6)，干旱脅迫抗性未見(jiàn)增強(qiáng)。

由于基因編輯植株在正常條件下即已出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，且產(chǎn)生的種子量較少，發(fā)芽力差，未能對(duì)OsSP1基因編輯植株進(jìn)行干旱處理和耐受性分析。

3 結(jié)論與討論

在擬南芥中，sp1基因是葉綠體蛋白輸入的控制基因，并通過(guò)該途徑控制葉綠體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而影響植物的逆境響應(yīng)能力[9，11]。葉綠體的功能與植物的光合效率直接相關(guān)，對(duì)于水稻等農(nóng)作物，葉綠體蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性將直接影響到作物的產(chǎn)量和抗逆性[29]。為確定水稻OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及脅迫抗性的影響，本研究通過(guò)基因過(guò)表達(dá)技術(shù)創(chuàng)建了OsSP1基因過(guò)表達(dá)植株，通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在OsSP1基因編碼區(qū)選擇了雙靶點(diǎn)進(jìn)行編輯，獲得了基因編輯植株。水稻SP1蛋白與擬南芥SP1蛋白高度同源[14]，屬于泛肽E3連接酶家族成員[12]。靶序列1和靶序列2的突變分別會(huì)造成SP1蛋白從第97個(gè)或第199個(gè)氨基酸(或其附近)開(kāi)始發(fā)生移碼突變或片段缺失，這2個(gè)位點(diǎn)均位于蛋白質(zhì)分子中2個(gè)跨膜區(qū)之間的肽段上[14]，發(fā)生移碼突變后，其下游結(jié)構(gòu)，包括第220-250位氨基酸殘基區(qū)的跨膜序列，以及羧基端非跨膜肽段中的RING(Really interesting new gene)保守結(jié)構(gòu)域，都將受到嚴(yán)重影響，造成SP1不能與泛肽系統(tǒng)中的泛肽結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)發(fā)生識(shí)別[11]，從而失去既定功能。

在正常生長(zhǎng)條件下，擬南芥sp1突變體的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型植株并無(wú)差別[9]。與擬南芥不同，水稻OsSP1基因編輯植株在正常生長(zhǎng)條件下即表現(xiàn)出葉綠素水平顯著或極顯著下降、早衰、不分蘗、低結(jié)實(shí)率或不結(jié)實(shí)等表型。由于氧化脅迫是引發(fā)葉片早衰的重要因素[30-32]，并且sp1在擬南芥中的作用機(jī)制與氧化脅迫有關(guān)[9]，本研究也對(duì)水稻過(guò)表達(dá)和基因編輯植株進(jìn)行了H2O2檢測(cè)，但過(guò)表達(dá)和基因編輯植株中H2O2的生成水平相比野生型植株均無(wú)明顯變化，說(shuō)明在OsSP1基因編輯植株中，早衰等表型可能并不是氧化脅迫導(dǎo)致。根據(jù)OsSP1基因編輯植株的生長(zhǎng)狀況和顯著或極顯著降低的葉綠素水平，可確定OsSP1基因突變引發(fā)了葉綠體蛋白質(zhì)組整體水平的變化和植物體的全面代謝失調(diào)[8]，從而造成了矮小、早衰、減產(chǎn)或失去育性等嚴(yán)重缺陷，而不只局限于與光反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的輸入失調(diào)和氧化脅迫。根據(jù)Pan等[33]的報(bào)道，擬南芥中存在sp1基因的同源基因，當(dāng)sp1基因突變后，其部分功能可能由同源基因替代，因此，擬南芥sp1突變體在正常條件下沒(méi)有出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)缺陷。根據(jù)水稻OsSP1基因編輯植株的表型，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果[14]，推測(cè)水稻中沒(méi)有類似的同源基因補(bǔ)充OsSP1突變后缺失的功能，因此，OsSP1突變直接干擾了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，并且其影響程度遠(yuǎn)超過(guò)sp1突變對(duì)擬南芥的影響。

擬南芥的sp1過(guò)表達(dá)植株在正常生長(zhǎng)條件下與野生型植株表型一致，但對(duì)滲透脅迫和鹽脅迫的抗性明顯增強(qiáng)[9]。水稻的OsSP1過(guò)表達(dá)植株在正常條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)和結(jié)實(shí)情況與野生型植株也無(wú)明顯差異，但與擬南芥不同的是，在干旱處理后，OsSP1過(guò)表達(dá)植株的抗性也未見(jiàn)明顯變化，表明在水稻中過(guò)量表達(dá)OsSP1后，對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和干旱抗性均無(wú)明顯的促進(jìn)作用，也無(wú)明顯的干擾。

OsSP1基因編輯植株和過(guò)表達(dá)植株的表型和生理生化指標(biāo)顯示了OsSP1基因?qū)λ旧L(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控作用，提高基因表達(dá)水平對(duì)水稻的生長(zhǎng)和干旱抗性無(wú)明顯影響，但基因突變嚴(yán)重影響水稻植株的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí)，其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘。