摘要：腸球菌（Enterococci）作為條件性致病菌廣泛存在于人和動(dòng)物中，其耐藥性和致病性隨地區(qū)和動(dòng)物來(lái)源的不同而變化。據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，關(guān)于武漢市馬源腸球菌的耐藥性研究相當(dāng)匱乏。以武漢市2個(gè)馬術(shù)俱樂(lè)部42匹溫血馬為主要研究對(duì)象，分別對(duì)馬匹糞便進(jìn)行樣品搜集并進(jìn)行耐藥研究（氨芐西林，四環(huán)素，慶大霉素，頭孢氨芐，恩諾沙星，氯霉素，諾氟沙星，紅霉素，萬(wàn)古霉素、林可霉素等）。結(jié)果顯示，從42份樣本中分離出10株糞腸球菌，分離率為23.8%;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株中有6株為慶大霉素耐藥，6株為頭孢類抗生素耐藥，2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥，其他藥物未產(chǎn)生耐藥性。結(jié)果表明該俱樂(lè)部馬源腸球菌已對(duì)慶大霉素和頭孢類抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥性，試驗(yàn)為該馬術(shù)俱樂(lè)部用藥提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬源腸球菌（Enterococcus）;耐藥性;武漢市

中圖分類號(hào)：S852.61+1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2021）07-0017-03

腸球菌（Enterococcus）為觸媒陰性、單個(gè)或鏈狀排列的格蘭氏陽(yáng)性球菌，是人及動(dòng)物微生物群中正常存在的一部分，一般不會(huì)引起發(fā)病，屬于條件性致病菌[1，2]。有學(xué)者報(bào)道，腸球菌屬菌種有19個(gè)，主要有鳥(niǎo)腸球菌（E. avium）、病臭腸球菌（E. malodoratus）、棉子糖腸球菌（E. raffinosus）、糞腸球菌（E. faecalis）、屎腸球菌（E. faecium）、鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）、蒙氏腸球菌（E. mundtii）、殊異腸球菌（E. dispar）、盲腸腸球菌（E. cecorum）和孤立四聯(lián)球菌（E. Solitarius）等，至2003年確定的腸球菌屬已增至31種[3]。在正常人群中，堅(jiān)忍腸球菌（E. durans）和海氏腸球菌（E. Hirae）攜帶率分別為18%和9%。而在家畜中，堅(jiān)忍腸球菌主要存在于牛及仔雞中。腸球菌的分布隨地區(qū)不同而不同，在西班牙臨床上主要的腸球菌種為糞腸球菌與屎腸球菌，而在瑞典等國(guó)家主要為屎腸球菌和海氏腸球菌。腸球菌一直被認(rèn)為是非致病性陽(yáng)性菌存在，臨床風(fēng)險(xiǎn)很小，但近年來(lái)很多研究發(fā)現(xiàn)腸球菌是導(dǎo)致外科傷口、血液、泌尿道、腦膜和血管感染的主要醫(yī)院病原體[4]，目前，由腸球菌引起的菌血癥及心內(nèi)膜炎已在醫(yī)院廣泛存在，其中糞腸球菌是主要病原體，其次是屎腸球菌，而其他腸球菌種很少見(jiàn)發(fā)病。

腸球菌細(xì)胞壁較厚，故對(duì)多種藥物具有天然耐藥性，但也更易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性。近年來(lái)，由于抗生素在臨床上的廣泛使用，腸球菌耐藥菌株不斷增多。至今萬(wàn)古霉素的耐藥菌株已廣泛存在，某些抗生素甚至達(dá)到完全耐藥，且有研究表明，腸球菌攜帶的耐藥基因可在人和動(dòng)物之間進(jìn)行傳播，給臨床治療帶來(lái)了很大難題，對(duì)動(dòng)物及人類健康造成了嚴(yán)重威脅。然而，根據(jù)武漢馬術(shù)協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)顯示，歷年來(lái)武漢馬術(shù)俱樂(lè)部及相關(guān)工作人員的數(shù)量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，這無(wú)疑增加了人畜共患病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)。由于武漢市馬源腸球菌的耐藥性調(diào)查數(shù)據(jù)極其缺乏，鑒于此，本研究對(duì)武漢馬術(shù)俱樂(lè)部進(jìn)行隨機(jī)抽查，對(duì)其腸球菌分離和耐藥情況進(jìn)行調(diào)查，旨在為當(dāng)?shù)伛R匹疾病的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以武漢市2個(gè)馬術(shù)俱樂(lè)部為主要研究對(duì)象，分別對(duì)42匹溫血馬匹進(jìn)行糞便樣品采集，于-20 ℃保存。采樣時(shí)認(rèn)真記錄編號(hào)，并調(diào)查俱樂(lè)部飼養(yǎng)管理、既往病史、役用及用藥情況。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腸球菌的分離及初步鑒定 腸球菌的初步分離按照鏈球菌培養(yǎng)方式進(jìn)行。樣品做預(yù)處理后，置于含20%兔血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)，過(guò)夜后蘸取菌液接種于TSA培養(yǎng)基中，24 h后觀察菌落形態(tài)。表面扁平、光滑并呈灰白色菌落初步定為可疑菌落，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行格蘭式染色（陽(yáng)性球菌）、觸酶試驗(yàn)（陰性者為腸球菌）、16 sDNA基因擴(kuò)增等進(jìn)行鑒定。

1.2.2 腸球菌耐藥性研究 對(duì)“1.2.1”中的菌株進(jìn)行KB紙片擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果根據(jù)CLSI《美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定結(jié)果與分析

對(duì)2個(gè)馬術(shù)俱樂(lè)部共計(jì)42份樣本分離出的10個(gè)菌株樣品分別進(jìn)行革蘭氏染色（圖1）、生化試驗(yàn)（表1）和觸酶試驗(yàn)鑒定，結(jié)果初步鑒定為糞腸球菌，分離率為23.8%。

對(duì)初步鑒定為腸球菌菌株再次進(jìn)行16sDNA PCR擴(kuò)增（圖2），進(jìn)一步確定為腸球菌。對(duì)16s DNA擴(kuò)增引物測(cè)序并進(jìn)行Blast對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，H8樣本與糞腸球菌同源性最高。

2.2 耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

將所有分離菌株進(jìn)行KB紙片擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示10株腸球菌菌株中有6株為慶大霉素耐藥（60%），6株為頭孢類抗生素耐藥（60%），2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥（20%），且據(jù)馬主陳述，采樣之前3個(gè)月內(nèi)均未使用抗生素進(jìn)行治療。具體結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。

3 小結(jié)與討論

腸球菌是革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌。曾被認(rèn)為是非致病性共生體，臨床風(fēng)險(xiǎn)很小。最近調(diào)查顯示，腸球菌是引起人類醫(yī)院感染的第二大革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是導(dǎo)致手術(shù)傷口、尿路、腦膜和心內(nèi)膜感染的主要醫(yī)源病原體[5]。腸球菌對(duì)低至高水平的幾種抗菌素本能具有耐藥性，包括內(nèi)酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷類和林可亞胺[6]。醫(yī)院感染率的增加可部分歸因于人類醫(yī)院大量使用抗菌素和腸球菌耐藥（AR）菌株的發(fā)展[7]。然而，馬源腸球菌研究相當(dāng)匱乏[8]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，武漢市2個(gè)馬術(shù)俱樂(lè)部糞腸球菌分離率為23.8%，與韓國(guó)賽馬管理局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和其他動(dòng)物如藏豬分離率相比均較低[9]，這可能與本試驗(yàn)采樣點(diǎn)局限性有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明2個(gè)馬術(shù)俱樂(lè)部馬源腸球菌耐藥率較高，其中慶大霉素和頭孢氨芐耐藥率均達(dá)到60%，而混合耐藥率為20%（慶大霉素和頭孢氨芐）。本次試驗(yàn)結(jié)果耐藥率較高，雖可能跟樣本數(shù)量有關(guān)，但仍需引起注意。本次試驗(yàn)結(jié)果耐藥性與藏豬源腸球菌耐藥結(jié)果相似[9]，但與韓國(guó)馬源耐藥率（70.6%）相比較低，與葡萄牙部分地區(qū)馬源腸球菌耐藥性相比則較高（8.8%）[10，11]。

綜上所述，這是首次對(duì)武漢市馬術(shù)俱樂(lè)部腸球菌進(jìn)行采樣耐藥研究。結(jié)果顯示，腸球菌優(yōu)勢(shì)種為糞腸球菌，且耐藥性較為嚴(yán)重。通過(guò)韓國(guó)研究者報(bào)道顯示，耐藥性腸球菌在馬之間或馬與其環(huán)境之間可以傳播，這意味著從馬傳播到人類尤其是成為騎手、馬工等馬業(yè)工作者的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，筆者后期將繼續(xù)研究武漢市馬源腸球菌與周圍環(huán)境之間的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1] FISHER K， PHILLIPS C. The ecology， epidemiology and virulence of Enterococcus[J]. Microbiology， 2009， 155： 1749-1757.

[2] MOHAMED J A， HUANG D B. Biofilm formation by enterococci[J]. J Med Microbioh ，2007， 56： 1581-1588.

[3] 李金鐘.腸球菌分類與鑒定新進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2006，24（3）：228-230.

[4] ARIAS C A， MURRAY B E. Emergence and management of drug-resistant enterococcal infections[J]. Expert Rev Anti Infect? Ther，2008， 6（5）： 637-655.

[5] HIDRON A I ， EDWARDS J R， PATEL J， et al. NHSN annual update：antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections：annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention， 2006—2007[J]. Infect Control Hosp? Epidemiol，2008， 29（11）： 996-1011.

[6] MURRAY B E. The life and times of the Enterococcus[J].Clin? Microbiol? Rev， 1990， 3（1）： 46-65.

[7] PALMER K L， KOS V N， GILMORE M S. Horizontal gene transfer and the genomics of enterococcal antibiotic resistance[J]. Curr? Opin? Micro biol， 2010， 13（5）： 632-639.

[8] 蘭彥芳，余 剛，丁 鵬，等.武漢市馬源腸球菌感染現(xiàn)狀分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)， 2019， 40（8）： 5-8.

[9] 蘭彥芳. 藏豬鏈球菌2型血清學(xué)調(diào)查及腸球菌耐藥性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[10]SINGH B R. Prevalence of vancomycin resistance and multiple drug resistance in enterococci in equids in North India[J]. J? Infect Dev Ctries， 2009， 3（7）： 498-503.

[11] MOURA I， RADHOUANI H， TORRES C， et al. Detection and genetic characterisation of vanA-containing Enterococcus strains in healthy Lusitano horses[J]. Equine Vet J， 2010， 42（2）：181-183.