張星暉，李婷婷，勵建榮,，于昕睿，梅佳林，徐宇辰，謝 晶，王 轟，王明麗，申照華，郭曉華，勞敏軍，周小敏，于建洋

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.上海海洋大學食品學院，上海 201306；4.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東 煙臺 265600；5.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276800；6.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316120；7.榮城泰祥食品股份有限公司，農業(yè)農村部冷凍調理海洋食品加工重點實驗室，山東 威海 264309）

隨著食品加工產業(yè)的迅速發(fā)展，食品質量與安全越來越受到公眾重視，為了有效保障食品品質、延長食品貨架期，開發(fā)新型包裝材料具有重要意義[1]。智能包裝正在我們的生活中慢慢普及，日益成為商品功能延伸和提升包裝商品附加值的最佳方案[2]。功能材料型智能包裝是通過具備溫敏、濕敏、氣敏等功能的材料，制成對環(huán)境因素具有“識別”和“判斷”的包裝[3]。應用于食品的氣敏包裝是利用食品在貯藏過程中產生的某些特征氣體與特定試劑產生特征顏色反應等引起包裝內指示劑的顏色變化[4]。這樣消費者無需破壞食品包裝就可以檢測食品品質與感知食品新鮮度，提高與消費者之間的互動性，從而減少由于食品變質而造成的浪費[5]。

目前有很多關于將智能包裝應用于食品新鮮度監(jiān)測的研究。Liu Xiuying等[6]開發(fā)出一種基于溴甲酚綠并涂在濾紙上的溶膠-凝膠基質層的比色傳感標簽來監(jiān)測魚的新鮮度；Jiang Guangyang等[7]以羧甲基纖維素/淀粉和紫甘薯花青素為原料制備了一種新型指示劑膜，用以監(jiān)測魚的新鮮度；Moradi等[8]以細菌納米纖維素和黑胡蘿卜花青素為基礎，研制了一種新型智能pH值傳感指示器，用于監(jiān)測虹鱒魚和鯉魚魚片在4 ℃條件下的保鮮/變質情況；但這類指示標簽的靈敏度還有待提高，且只能對魚的新鮮度起指示作用，功能較為單一。在所有固定指示劑的方法中，靜電紡絲是一種簡單而經濟有效的技術，并且可以同時負載除指示劑以外的功能活性物質[9]。且紡絲納米纖維具有高比表面積，這使得它能夠負載更多的活性物質，提供更高效的催化性能[10]，在理論上可使智能包裝的靈敏度更高，反應時間更短，對于提高智能指示包裝的性能有一定的價值[11]。

金槍魚棲息于大西洋和地中海的熱帶和溫帶水域[12]。魚肉富含蛋白質、硒、VB6和Ω-3脂肪酸[13]，常用來制作壽司和刺身[14]，具有很高的商業(yè)價值。但高脂肪含量也是導致金槍魚肉易腐敗的重要因素。為了實時監(jiān)測金槍魚肉的新鮮度，避免因變質造成的浪費，可對其設計智能包裝，通過肉眼分辨其新鮮度。溴麝香草酚藍（bromothymol blue，BTB）在pH 6.0～7.6的環(huán)境中顏色由黃變藍[15]，因此將BTB作為食品的新鮮度指示智能標簽的顯色材料，靈敏且安全[16]。

因此，本實驗將玉米醇溶蛋白（zein，ZN）與BTB共混進行靜電紡絲，制成肉眼可見顏色變化的智能指示標簽，應用于金槍魚的新鮮度監(jiān)測中，對其進行表征，并通過此指示標簽對金槍魚肉新鮮度的監(jiān)測效果進行了評價。以金槍魚魚片在4 ℃貯藏0～6 d的總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和不同BTB添加量的指示標簽的色度做比較，選出指示效果最佳的指示標簽，驗證指示標簽在金槍魚新鮮度監(jiān)測中的效果。本實驗可為BTB/ZN指示標簽在金槍魚新鮮度監(jiān)測方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鰭金槍魚（體長約為2 m，質量約為100 kg）購于大連市水產市場。

溴麝香草酚藍 北京索萊寶科技有限公司；玉米醇溶蛋白 上海麥克林生化科技有限公司；氧化鎂、氫氧化鈉、硼酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、無水乙醇等均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

ET-2535H型靜電紡絲設備 北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；Scimitar 2000 Near型傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR） 美國安捷倫公司；Ultima IV型X射線粉末衍射儀 日本Rigaku公司；Q2000-3236型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC） 美國TA儀器公司；Czone系列抑菌圈測定及菌落計數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BTB溶液紫外-可見光譜比色分析

在紫外-可見分光光度計上分別測定了pH值為5～12時質量分數(shù)為1% BTB溶液的紫外-可見光譜（350～750 nm），其中pH 5～12的緩沖溶液是由0.1 mol/L的硼酸和氫氧化鈉配制而成。

1.3.2 BTB/ZN紡絲液的制備

參考文獻[17]，將ZN加入到燒杯中，再倒入冰乙酸與無水乙醇體積比為2.5∶7.5的混合溶液，制成質量分數(shù)為40%的ZN紡絲溶液，在室溫下用磁力攪拌器攪拌1 h，混合均勻。經預實驗確定較為適宜的BTB添加量范圍，再在攪拌均勻的ZN紡絲溶液中加入不同質量的BTB攪拌1 h，待其完全溶解后得到BTB質量分數(shù)分別為0%、3%、4%、5% BTB/ZN紡絲液。

1.3.3 BTB/ZN指示標簽的制備

取5 mL上述不同質量分數(shù)的BTB/ZN紡絲液，調節(jié)正電壓為10.55 kV，負電壓為－1.95 kV，紡絲距離為12 cm，在溫度20 ℃、相對濕度50%的條件下進行紡絲，并將得到的紡絲膜放在25 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，得到BTB/ZN紡絲膜，即BTB/ZN指示標簽，用于后續(xù)實驗。

1.3.4 BTB/ZN指示標簽的表征

取1.3.3節(jié)制備的BTB/ZN指示標簽，以不添加BTB的ZN紡絲膜作為對照，用于后續(xù)的表征。

1.3.4.1 微觀形貌的觀察

將測試樣品噴金，再使用SEM在3 kV電壓下檢查樣品表面形貌。采用ImageJ圖像分析軟件統(tǒng)計4 種樣品的纖維直徑分布率。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

將測試樣品剪碎后與溴化鉀按1∶50（m/m）比例研磨制片。以KBr為背景使用FTIR進行測定，在光譜掃描范圍為4 000～500 cm－1、分辨率為4 cm－1、步寬為2 cm－1的條件下掃描，每個樣品掃描兩次。

1.3.4.3 X射線衍射分析

用CuKα輻射，在管壓40 kV、電流50 mA、測量角2θ掃描范圍5°～70°的條件下對樣品進行X射線衍射并分析其結晶度。

1.3.4.4 熱力學分析

用DSC法分析1.3.3節(jié)中不同質量分數(shù)的BTB/ZN指示標簽。用分析天平稱取5.00 mg的指示膜，在氮氣氣氛（50 mL/min）下，初始溫度為25 ℃，以10 ℃/min的恒定速率升溫，測定其熱穩(wěn)定性。

1.3.5 BTB/ZN指示標簽在金槍魚中的應用分析

取黃鰭金槍魚背部魚肉通過保溫箱運至實驗室后立即進行加工處理。金槍魚魚肉樣品處理如下：將魚肉分成10.00 g小塊，放入透明培養(yǎng)皿密封，在每個培養(yǎng)皿的頂部空間放置了BTB/ZN指示標簽（面積為1 cm2），進行新鮮度監(jiān)測。實驗在冷藏溫度（4 ℃）下進行，每天記錄魚肉的菌落總數(shù)、TVB-N含量、pH值及BTB/ZN指示標簽的顏色，每次實驗3 個平行。

1.3.5.1 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[18]。取10.00 g金槍魚魚肉和90 mL無菌生理鹽水一同倒入無菌蒸煮袋中，拍打1 min后梯度稀釋至合適濃度。取稀釋好的菌液1 mL于培養(yǎng)皿中，再傾注約25 mL的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，充分搖晃，待培養(yǎng)基凝結后于28 ℃培養(yǎng)箱倒扣培養(yǎng)。

1.3.5.2 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[19]。稱取5.00 g攪碎的金槍魚魚肉至消化管中，再加入0.50 g氧化鎂粉末，混勻，將消化管連接到全自動Kjeldahl分析儀并進行分析。計算TVB-N含量，并以mg/100 g表示。

1.3.5.3 pH值的測定

參照文獻[20]，稱取5.00 g攪碎的金槍魚魚肉，加入45 mL蒸餾水，用均質機進行均質后，靜置30 min，過濾，用pH計測定濾液的pH值。

1.3.5.4 圖像和數(shù)據(jù)采集

指示標簽圖像由Czone系列抑菌圈測定及菌落計數(shù)儀采集，再用Photoshop軟件進行進一步處理，提取R、G、B值。為了計算與每個不同BTB添加量的指示標簽歸一化R、G、B值相關的色度參數(shù)，參考文獻[21]計算色度參數(shù)X來表征顏色的變化。

式中：X為表示顏色變化的色度參數(shù)；R指紅色值；G指綠色值；B指藍色值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗設置3 個平行，使用SPSS Statistics 19軟件進行Duncan多重比較顯著性分析，采用Pearson法進行相關性分析。使用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 BTB溶液的紫外-可見光譜比色結果

從圖1A中能夠看出BTB溶液在不同pH值下的顏色變化情況：黃色（pH 5～6）、綠色（pH 7～8）、藍色（pH 9～10）和墨藍色（pH 11～12）。如圖1B所示，在pH 5時，在431 nm和616 nm處各有一個吸收峰，且431 nm處的吸收峰峰高比616 nm處的吸收峰略高；在pH 8時，在426 nm和615 nm處各有一個吸收峰，且這兩個吸收峰的峰高幾乎相同；在pH 9時，在407 nm和613 nm處各有一個吸收峰，且613 nm處的吸收峰峰高大于407 nm處的吸收峰。這是由于溴百里酚藍是一種有機弱酸，在低pH值（5～6）下，溶液中的主要成分是溴麝香草酚藍的黃色酸式（acid bromothymol blue，HBB）。隨著pH值的增加，溴百里酚藍的藍色堿式BB－的濃度逐漸增加，并引起淺綠色的顏色變化（pH 7～8）。隨著pH值繼續(xù)增加至9～12，產生大量的藍色BB－[22]。此外，溶液的最大吸收峰隨著pH值的增加而轉移到更高的波長。BTB在pH值為5～12時的明顯顏色變化可使BTB/ZN指示標簽具有良好的pH值指示效果。

圖1 不同BTB溶液的顏色和紫外-可見光譜Fig. 1 Color and ultraviolet-visible spectra of BTB solution at different pHs

2.2 BTB/ZN指示標簽的微觀形貌

圖2為BTB/ZN指示標簽的微觀形貌和直徑分布圖。從圖2A中可以看出，ZN具有優(yōu)良的紡絲性能，靜電紡絲ZN纖維呈圓柱形，表面光滑。纖維直徑集中分布在275～325 nm之間。而添加BTB后的BTB/ZN指示標簽纖維直徑明顯增大，BTB質量分數(shù)為3%的BTB/ZN指示標簽纖維直徑較均勻地分布在425～450 nm之間；質量分數(shù)為4%的BTB/ZN指示標簽纖維直徑較均勻地分布在550～600 nm之間；質量分數(shù)為5%的BTB/ZN指示標簽纖維直徑較均勻地分布在700～750 nm之間，總體形貌較好。纖維直徑隨BTB添加量增加而增加，可能是因為隨著BTB質量分數(shù)的增加，紡絲所需電壓增加，在靜電紡絲中納米纖維形態(tài)的影響是隨著電壓的增強，納米纖維會變得更粗，并且紡絲過程中的不穩(wěn)定性更加明顯[23]。因此BTB/ZN指示標簽的纖維直徑較ZN膜明顯增大。這與覃小紅等[24]的研究結果一致。

圖2 不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽的SEM圖和直徑分布圖Fig. 2 SEM and diameter distribution of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.3 BTB/ZN指示標簽的FTIR分析結果

如圖3所示，ZN紡絲膜的FTIR光譜在3 312 cm－1處有較寬的吸收峰，這是由于大量的O—H伸縮振動。1 663 cm－1處的吸收峰為C—O伸縮振動，屬于酰胺I帶；1 534 cm－1處的吸收峰為N—H平面內彎曲振動和C—N振動，屬于酰胺II帶，這與饒震紅等[25]的結果相一致。另外，此兩處的峰位在添加不同質量分數(shù)的BTB后均沒有發(fā)生明顯的變化。BTB/ZN指示標簽中BTB指紋區(qū)的峰幾乎全部消失，說明ZN與BTB發(fā)生了非鍵合作用。與ZN紡絲膜相比，BTB/ZN指示標簽在3 000～3 500 cm－1處的峰寬變窄，說明指示標簽中的氫鍵數(shù)量減少。含3%、4%、5% BTB的BTB/ZN指示標簽之間的FTIR光譜幾乎無差別，可能是BTB的添加量較少，對于紅外光譜的影響不大。上述結果表明，BTB與ZN混合以后，并未明顯改變ZN的二級結構，與焦巖等[26]的研究結果一致。

圖3 BTB粉末、ZN紡絲膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽FTIR圖Fig. 3 FTIR spectra of BTB, ZN and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.4 BTB/ZN指示標簽的XRD分析結果

如圖4所示，ZN粉末在2θ＝8.7°出現(xiàn)了一個特征峰，并且在2θ＝20.7°存在一個較強的衍射峰，這與它具有α-螺旋晶體結構的特性相一致。ZN紡絲膜在2θ＝8.7°、20.7°處的衍射峰與ZN粉末相比變得更平緩，這是由于ZN粉末溶于乙酸和乙醇的復合溶液之后再紡絲，阻礙聚合物的結晶度，致使峰值變緩或位移[27]。另外，不同BTB添加量的指示標簽都僅在2θ＝20.9°處出現(xiàn)了一個較強的衍射峰，這表明紡絲膜指示標簽為非晶態(tài)的無定形物，但結構中存在著一定的有序性。若各單組分分子之間未發(fā)生或僅有微弱的相互作用，那么XRD圖譜僅顯示各組分衍射圖譜按比例簡單疊加。圖中可以看出BTB/ZN指示標簽的各衍射峰不僅僅是BTB和ZN兩者衍射峰的簡單疊加，在BTB/ZN指示標簽的衍射圖中，BTB和ZN的各特征衍射峰均在一定程度上減弱或消失，且由于BTB添加量相對很少，其特征峰消失得更多。這表明在反應體系各組分間存在較強的作用力，從而導致單組分的結晶性發(fā)生變化。

圖4 ZN粉末、ZN紡絲膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽XRD圖Fig. 4 XRD spectra of ZN powder, ZN spinning film and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.5 BTB/ZN指示標簽的熱力學分析結果

由圖5可知，ZN粉末僅在127 ℃附近出現(xiàn)1 個負峰，對應于聚合物鏈的解離。ZN紡絲膜在132 ℃附近出現(xiàn)吸熱峰。相比較ZN粉末而言，ZN紡絲膜最大吸熱峰發(fā)生略微的偏移，且峰寬變大，這可能是由于靜電紡絲工藝略微改變了ZN紡絲膜的理化性質，從而提高了熔融溫度[28]。對于BTB粉末，在200 ℃以下沒有發(fā)現(xiàn)BTB粉末的特征峰，這有可能是BTB的熔點過高，在測量范圍內無法顯示。對于BTB添加量為3%、4%、5%的BTB/ZN指示標簽，其吸熱峰分別在125、134、140 ℃，可以看出隨BTB添加量的增加，BTB/ZN指示標簽的熔融溫度也逐漸略微升高，這可能是因為BTB與ZN粉末混合后，沒有改變BTB的晶體結構。這與FTIR結果相一致，但由于BTB添加量很少，所以對于紡絲膜熔融溫度的影響不大?？梢缘贸觯珺TB/ZN指示標簽隨BTB添加量增加，熱穩(wěn)定性逐漸增強。

圖5 BTB粉末、ZN粉末、ZN紡絲膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽的DSC圖Fig. 5 DSC diagrams of BTB, ZN powder, ZN spinning film and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.6 BTB/ZN指示標簽對金槍魚片鮮度指示的應用

如圖6A、7所示，貯藏初始金槍魚魚片的菌落總數(shù)為（3.67±0.75）（lg（CFU/g）），指示標簽的顏色為橙黃色，隨著貯藏時間的延長，菌落總數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢；貯藏3 d時金槍魚魚片的菌落總數(shù)為（4.89±0.38）（lg（CFU/g）），此時指示標簽的顏色為綠色（圖7D）；貯藏5 d樣品組的菌落總數(shù)達到了（7.47±0.45）（lg（CFU/g）），已超過國際食品微生物委員會的規(guī)定（應低于106CFU/g），表明此時的魚片已經腐敗變質，此時指示標簽的顏色為藍色（圖7F）。TVB-N含量是蛋白質經微生物的分解作用產生氨和胺類等堿性含氮物質的總含量，如圖6B所示，金槍魚魚片的初始TVB-N含量為（7.63±0.02）mg/100 g，此時的指示標簽呈橙黃色；貯藏3 d時金槍魚魚片TVB-N含量為（12.59±0.01）mg/100 g，此時指示標簽的顏色由橙黃色變?yōu)榫G色，在貯藏5 d時，金槍魚魚片TVB-N含量為（21.18±0.05）mg/100 g，此時的指示標簽顏色由墨綠色變?yōu)樗{色，魚肉已完全腐敗（TVB-N含量高于20 mg/100 g）。如圖6C所示，金槍魚魚片在貯藏期間的pH值在前2 d變化不大，在貯藏3 d開始迅速升高，在貯藏5 d升高速度變緩。這是由于在貯藏前期魚片中存在一定量的乳酸，使得pH值較為穩(wěn)定，甚至略有下降，而后腐敗微生物數(shù)量增多，分解蛋白質產生堿性物質，導致pH值升高。

圖6 金槍魚魚片貯藏期間的鮮度指標變化Fig. 6 Changes in freshness indexes of tuna fillets during storage

圖7 指示標簽對金槍魚魚片的指示效果Fig. 7 Indication effects of indication label on tuna fillets

2.7 BTB/ZN指示標簽指示效果

GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》[29]規(guī)定，鮮海水魚中TVB-N的含量在0～15 mg/100 g為優(yōu)級品；TVB-N的含量在15～30 mg/100 g為合格品。由圖6B可知，在貯藏0～4 d時金槍魚魚片處于優(yōu)級品級別；5～6 d時金槍魚魚片處于合格品級別。由表1可知，X2在2～3 d和4～5 d之間變化最大，即在鮮度變化的時間點發(fā)生了最明顯的顏色變化。當指示劑添加量較少時，顏色指示效果受壁材限制，無法發(fā)揮到最佳效果，但在一定范圍內，色素含量越小的標簽，其顏色變化反而越大[30]。

表1 不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽在金槍魚魚片貯藏期間的色度參數(shù)變化Table1 Changes of chromaticity parameters of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts when used to detect freshness of tuna fillets during storage

指示標簽的色度變化與魚肉pH值、TVB-N含量、菌落總數(shù)之間的相關性分析如表2所示，除pH值和X1外，其他指標之間均顯著相關（P＜0.05）。另外TVB-N含量與X2之間的Pearson相關系數(shù)（—0.839）絕對值最大（≥0.8），即二者極強相關。因此選用BTB添加量為4%的指示標簽并以TVB-N含量作為指標進行應用，即當BTB添加量為4%時BTB/ZN指示標簽的指示效果更加明顯，即為最佳指示標簽。

表2 不同BTB添加量的BTB/ZN指示標簽色度變化與pH值、TVB-N含量、菌落總數(shù)變化相關性與顯著性分析Table2 Correlation and significance analysis between color change of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts and changes in pH,TVB-N content and total viable count

3 結 論

本研究采用單軸靜電紡絲工藝制備了一種基于BTB指示劑的金槍魚魚肉新鮮度指示標簽，通過SEM、FTIR、XRD、DSC等對BTB/ZN指示標簽的形貌和結構進行表征，并將其應用于金槍魚4 ℃保鮮實驗中。結果表明，BTB/ZN指示標簽的微觀結構良好；指示標簽中各組分之間不發(fā)生化學反應；指示標簽的熱穩(wěn)定性良好。通過測定指示標簽的顯色效果，發(fā)現(xiàn)其對金槍魚魚肉的新鮮度具有明顯的指示作用，指示標簽隨時間的變化，顏色從橙黃色變?yōu)槟G色再變?yōu)樯钏{色，并且當BTB添加量為4%時，可以靈敏地指示金槍魚魚肉的鮮度變化。另外，BTB/ZN指示標簽作為一種新型的指示標簽，還可以負載揮發(fā)性抑菌物質，作為一種多功能新型包裝材料應用于食品工業(yè)。