張映曈，張?jiān)?2，趙歡歡,2，胡花麗，張雷剛，周宏勝，羅淑芬，李鵬霞,2,3,

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

近年來(lái)，飲食引起的慢性疾病流行已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。食用富含生物活性物質(zhì)的食物，“使食物成為藥物，使藥物來(lái)源于食物”成為國(guó)內(nèi)外食品和生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。娃娃菜（Brassica pekinensis）屬十字花科蕓薹屬白菜亞種，因外形美觀小巧、口感清脆、味道鮮美而備受消費(fèi)者喜愛(ài)。更重要的是，娃娃菜中含有抗壞血酸、多酚、花色苷和硫代葡萄糖苷等活性成分[2]，具有清除自由基、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、激活抗氧化酶體系等生物學(xué)功能[3]。流行病學(xué)研究指出食用以上活性成分可顯著降低罹患心腦血管疾病、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)（電場(chǎng)強(qiáng)度15～20 kV/cm）是一種在食品中應(yīng)用的新型非熱處理技術(shù)，可通過(guò)滅活微生物和酶使食品貨架期延長(zhǎng)4～6 周[5]。除了殺菌、滅酶，脈沖電場(chǎng)技術(shù)在其他方面的功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。例如，高壓脈沖電場(chǎng)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞通透性，因而可用于特定成分的輔助提取[6]和加熱干燥前處理[7]。而中強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)（moderate intensity pulsed electric fields（MIPEF），電場(chǎng)強(qiáng)度低于5 kV/cm）則會(huì)誘導(dǎo)植物的代謝應(yīng)激反應(yīng)，從而刺激次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和積累[8]。MIPEF的這種作用被認(rèn)為是通過(guò)生物電磁場(chǎng)改變細(xì)胞內(nèi)部電荷的分布情況，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)部電信號(hào)和能量的傳遞誘發(fā)具有防御作用的生物活性物質(zhì)（如多酚和花色苷等）合成及其他代謝應(yīng)激反應(yīng)，以調(diào)節(jié)各種生理活性[9]?；诖?，研究人員將MIPEF用于處理果蔬以獲得高生物活性物質(zhì)的輕度加工產(chǎn)品。

目前，在西紅柿、土豆和鮮切蘋(píng)果中關(guān)于MIPEF處理誘導(dǎo)生物活性物質(zhì)代謝變化的研究較多[10-12]，對(duì)于其他種類(lèi)的果蔬還缺乏足夠系統(tǒng)的理論研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以娃娃菜為研究對(duì)象，探討不同MIPEF處理參數(shù)（電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比）對(duì)其生物活性成分（酚類(lèi)物質(zhì)、抗壞血酸、谷胱甘肽、總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯）含量以及抗氧化能力的影響，并對(duì)處理參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期得到活性物質(zhì)含量較高的娃娃菜。研究成果將有助于加深對(duì)MIPEF預(yù)處理誘導(dǎo)果蔬代謝應(yīng)激機(jī)制的理解，推動(dòng)電磁微能技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)為開(kāi)發(fā)適用于未來(lái)果蔬采后產(chǎn)業(yè)的MIPEF設(shè)備和技術(shù)參數(shù)確定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高山娃娃菜產(chǎn)自甘肅蘭州，2019年4月采購(gòu)于南京眾彩蔬菜批發(fā)市場(chǎng)，采購(gòu)1 h內(nèi)運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。

乙醇、甲醇、二氯甲烷、硼酸、氯化鈀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚、5-磺基水楊酸、谷胱甘肽還原酶、鄰二氮菲、三氯乙酸 上海源葉生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉、鐵氰化鉀、鄰苯三酚 南京百斯凱科技有限公司；鄰苯二硫醇 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氧化型谷胱甘肽 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DMC-200脈沖電場(chǎng)發(fā)生器（輸出電壓0～70 kV、占空比0.0%～49.2%） 大連鼎通科技發(fā)展有限公司；UV-1102紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Sigma3k15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；IKAA11BS25液氮研磨器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；PL202-L天平 瑞士Mettler Toledo公司；PHSJ-3F pH計(jì) 上海雷磁新徑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脈沖電場(chǎng)處理

選擇大小均勻、無(wú)明顯機(jī)械損傷的娃娃菜進(jìn)行脈沖電場(chǎng)處理?；谇捌趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果[13]，采用中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)娃娃菜脈沖電場(chǎng)處理參數(shù)，因素水平見(jiàn)表1。處理時(shí)間為1 min，每個(gè)處理重復(fù)3 次。以未經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理的娃娃菜作為對(duì)照。處理完成的娃娃菜和對(duì)照組立即轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱，放置24 h后，用液氮速凍并置于－20 ℃冰箱保存，待后續(xù)檢測(cè)分析。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of response surface tests

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 活性物質(zhì)含量測(cè)定

總酚含量：參照Ghasemnezhad等[14]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取1.0 g樣品，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液充分研勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取0.1 mL上清液與0.5 mL福林酚試劑于25 ℃反應(yīng)3 min，加入1.0 mL飽和碳酸鈉溶液，25 ℃孵育1.0 h，測(cè)定760 nm波長(zhǎng)處的溶液吸光度?？偡雍恳悦靠藰悠分兴瑳](méi)食子酸當(dāng)量表示，單位為μg/g。

花色苷含量：參照Mónica Giusti等[15]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取1.0 g樣品，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)95%酸化甲醇避光提取4 h，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液1.0 mL，加入2.5 mL KCl-HCl緩沖液（pH 1.0）和醋酸鈉緩沖液（pH 4.5），室溫靜置15 min，分別于520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度?；ㄉ蘸恳悦靠藰悠分泻杠?chē)菊素-3-O-葡萄糖苷當(dāng)量表示，單位為mg/g。

抗壞血酸含量：采用2,6-二氯靛酚法[16]測(cè)定抗壞血酸含量，單位為mg/g。

谷胱甘肽含量：采用Ma Fengwang等[17]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取1.0 g樣品，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%的5-磺基水楊酸溶液冰浴勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液0.2 mL，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）、0.2 mL 0.2 mol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、1.0 mol/L 0.8 mL 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、0.2 mL 1 U/mL谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR），27 ℃水浴40 min，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

總硫代葡萄糖苷含量：參照王淑雯[18]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取1.0 g樣品，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液80 ℃浸提15 min，10 000×g離心15 min，取上清液1.0 mL，加入1 mL 8.0 mmol/L氯化鈀顯色液和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%羧甲基纖維素鈉溶液各1.0 mL，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處吸光度?？偭虼咸烟擒蘸坑妹靠藰悠分兴诮孀榆债?dāng)量表示，單位為μg/g。

異硫氰酸酯含量：稱(chēng)取1.0 g樣品加入5 mL二氯甲烷振蕩萃取，4 ℃、10 000×g離心15 min，取500 μL上清液，加入2 mL甲醇、1.8 mL 50 mmol/L硼酸緩沖液和0.2 mL 7 mmol/L鄰苯二硫醇溶液，65 ℃下水浴1 h，于365 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。異硫氰酸酯含量以每克樣品中所含蘿卜硫素當(dāng)量表示，單位μg/g。

1.3.2.2 抗氧化酶活力測(cè)定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力：參照趙世杰等[19]的方法測(cè)定，以抑制氮藍(lán)四唑光化還原50%為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活力：采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[20]，以1 min內(nèi)470 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.01為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力：采用過(guò)氧化氫法測(cè)定[21]，以1 min內(nèi)240 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.1為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力：參考Mohamed等[21]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取3.0 g樣品加入10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5）勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液。反應(yīng)體系為：0.2 mL上清液、1.5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、1 mL 2 mmol/L H2O2、0.6 mL 0.5 mmol/L還原型抗壞血酸?；旌暇鶆蚝笥?90 nm波長(zhǎng)處測(cè)定3 min內(nèi)吸光度變化。以每克樣品每分鐘氧化1 μmol還原型抗壞血酸為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

GR活力：參考Ma Fengwang等[17]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取3.0 g樣品加入10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5）勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液。反應(yīng)體系為：0.4 mL上清液、2.0 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、1.0 mL 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽、1.0 mL 0.3 mmol/L NADPH。于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定3 min內(nèi)溶液吸光度變化。以每克樣品每分鐘催化1 nmol NADPH氧化為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

1.3.3 抗氧化能力測(cè)定

稱(chēng)取樣品1.0 g，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液充分研磨，轉(zhuǎn)移至10 mL刻度試管中，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液定容，浸提5 h，離心，收集上清液。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipenyl-2-pierylhydrazyl，DPPH）自由基清除率：參考Mohamed等[21]的方法略有改動(dòng)。取上清液0.5 mL，加入3 mL DPPH-乙醇溶液，反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

羥自由基清除率：參考Dong Tiantian等[22]的方法略有改動(dòng)。取上清液0.1 mL，加入2 mL磷酸緩沖液、0.3 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液、0.2 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，然后用1 mL體積分?jǐn)?shù)0.02% H2O2溶液補(bǔ)足體積至8 mL。37 ℃保溫1 h，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。

超氧陰離子自由基（O2－·）清除率：參考Alothman等[23]的方法略有改動(dòng)。取上清液0.5 mL，加入2.5 mL Tris-HCl緩沖液和0.25 mL 0.1 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分混勻，25 ℃反應(yīng)5 min后加入0.5 mL 0.8 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，于425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

總還原力：參照Soong等[24]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取樣品1.0 g，加入5 mL去離子水冰浴提取。取1.0 mL上清液與2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液避光條件下50 ℃反應(yīng)20 min，加入2.5 mL10 g/100 mL三氯乙酸溶液振蕩混勻。取混合溶液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水、0.5 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，室溫靜置10 min，測(cè)定700 nm波長(zhǎng)處吸光度。

以上結(jié)果均以每克樣品的抗壞血酸當(dāng)量表示，單位為mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。用Design-Expert 12.0進(jìn)行面中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)以及二次回歸方程擬合和預(yù)測(cè)。用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIPEF對(duì)娃娃菜中生物活性物質(zhì)含量的影響

2.1.1 總酚和花色苷含量

酚類(lèi)物質(zhì)是果蔬中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)果蔬的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有著重要影響。由表2可知，對(duì)照組娃娃菜總酚和花色苷含量分別為（236.25±14.05）μg/g和（44.91±3.82）mg/g，經(jīng)MIPEF處理后，試驗(yàn)2、3、5～7與對(duì)照組相比，兩種成分的含量均顯著提高（P＜0.05）。其中總酚含量較對(duì)照組提高了2.76%～39.40%，花色苷含量較對(duì)照組提高了34.58%～85.13%。這與Galindo等[10]在馬鈴薯中的研究結(jié)果相似，在MIPEF處理24 h后，馬鈴薯組織代謝表現(xiàn)出以多酚含量提高為特征的應(yīng)激反應(yīng)。這可能與MIPEF刺激下苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）的活性增強(qiáng)有關(guān)[25]。植物中的多酚主要是在苯丙氨酸代謝過(guò)程中通過(guò)PAL作用產(chǎn)生。MIPEF被認(rèn)為在細(xì)胞水平影響電壓門(mén)控離子通道，使Ca2＋大量涌入陽(yáng)離子通道，進(jìn)而促進(jìn)了Ca2＋依賴(lài)型蛋白激酶（Ca2＋-dependent protein kinase，CDPK）磷酸化PAL[26]。此外，CDPK還能促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生[27]，活性氧作為內(nèi)源信號(hào)分子可促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)合成以防御外界脅迫。

通過(guò)中心復(fù)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)考察了MIPEF不同電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜中總酚和花色苷含量的影響。由表2和圖1可知，隨電場(chǎng)強(qiáng)度的提高，總酚和花色苷含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)；隨占空比的增加，總酚和花色苷含量均呈上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y1＝241.02＋93.46X1＋0.18X2＋0.35X1X2－46.34X12＋0.008X22（總酚含量）和Y2＝49.92＋49.25X1＋0.28X2＋0.034X1X2－22.28X12－0.036X22（花色苷含量）。通過(guò)ANOVA（表3）可知，兩個(gè)回歸方程模型的P值均小于0.01，說(shuō)明模型極顯著；失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明失擬不顯著，決定系數(shù)R2分別為0.982 9和0.965 7，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度高，因此該模型能夠很好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）對(duì)總酚含量影響顯著（P＜0.05），占空比（X2）對(duì)總酚含量影響極顯著（P＜0.01），對(duì)花色苷含量影響顯著（P＜0.05）。因此，占空比對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響大于電場(chǎng)強(qiáng)度。

圖1 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜總酚（A）和花色苷（B）含量的影響Fig. 1 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of total phenols (A) and anthocyanins (B) in baby cabbage

表2 中心復(fù)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Central composition design in terms of coded and experimental data with responses variables

表3 回歸方程的方差分析Table3 Analysis of variance of regression models

2.1.2 抗壞血酸和谷胱甘肽含量

抗壞血酸和谷胱甘肽是重要的抗氧化成分，其含量是衡量娃娃菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)之一。由表2可知，試驗(yàn)2組與對(duì)照組相比，抗壞血酸含量顯著提升（P＜0.05），為（38.16±1.19）mg/g，比對(duì)照組升高了16.06%；谷胱甘肽含量在所有處理?xiàng)l件下均顯著提高（P＜0.05），是對(duì)照組的1.37～3.68 倍。這與Ade-Omowaye等[6]使用MIPEF處理紅椒的研究結(jié)果略有不同，電場(chǎng)強(qiáng)度2 kV、脈沖次數(shù)50 次、處理400 ms后立即檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIPEF處理紅椒中抗壞血酸含量沒(méi)有顯著提高，僅為對(duì)照組的89.6%～96.5%。這可能是因?yàn)橹参镒R(shí)別外界刺激并啟動(dòng)相應(yīng)防御系統(tǒng)積累刺激代謝產(chǎn)物需要一定的時(shí)間。Galindo等[10]的研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，即MIPEF處理要在長(zhǎng)時(shí)間作用后（以小時(shí)計(jì)量）才會(huì)影響組織代謝。本實(shí)驗(yàn)中娃娃菜經(jīng)MIPEF處理后置于4 ℃貯藏24 h后谷胱甘肽和抗壞血酸含量的提升進(jìn)一步證實(shí)了該觀點(diǎn)。

根據(jù)中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析MIPEF電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響，結(jié)果如表2和圖2所示。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，抗壞血酸和谷胱甘肽的含量先上升后下降；隨占空比的增加，抗壞血酸含量先上升后下降，而谷胱甘肽含量呈緩慢上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y3＝18.11＋23.58X1＋0.51X2－0.033X1X2－10.99X12－0.007 8X22（抗壞血酸含量）和Y4＝－2.30＋40.07X1－0.006 4X2＋0.11X1X2－16.45X12－0.004 2X22（谷胱甘肽含量）。采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析（表3）可知，回歸方程模型的P值均小于0.05，說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2分別為0.965 3和0.951 4，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度高，因此該模型能夠很好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）對(duì)抗壞血酸含量影響顯著（P＜0.05），占空比（X2）對(duì)抗壞血酸含量影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明占空比對(duì)抗壞血酸含量的影響大于電場(chǎng)強(qiáng)度；而對(duì)于谷胱甘肽含量，電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比均影響顯著（P＜0.05）。

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜抗壞血酸（A）和谷胱甘肽（B）含量的影響Fig. 2 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of ascorbic acid (A) and glutathione (B) in baby cabbage

2.1.3 總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯含量

硫代葡萄糖苷是十字花科植物中特有的抗氧化活性物質(zhì)，在黑芥子酶作用下水解成異硫氰酸酯，是評(píng)價(jià)娃娃菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[28]。由表2可知，經(jīng)MIPEF處理后娃娃菜中總硫代葡萄糖苷含量與對(duì)照組相比提高了9.8%～63.6%（除試驗(yàn)6），異硫氰酸酯含量則在所有處理?xiàng)l件下均有提高，提高幅度為55.70%～818.03%。MIPEF的這種作用可能與其他非生物脅迫如褪黑素、ZnSO4等相似，通過(guò)調(diào)控硫代葡萄糖苷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)提高硫代葡萄糖苷以及下游異硫氰酸酯的含量[29]。

根據(jù)中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析MIPEF電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯含量的影響，結(jié)果如表3和圖3所示。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯的含量均先上升后下降；隨占空比的增加，總硫代葡萄糖苷含量持續(xù)下降，異硫氰酸酯含量則呈上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y5＝1.66＋1.91X1－0.000 22X2－0.001 8X1X2－0.82X12－0.000 17X22（總硫代葡萄糖苷含量）和Y6＝－2.86＋20.65X1＋0.085X2＋0.009 4X1X2－9.10X12＋0.000 32X22（異硫氰酸酯含量）。采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（表3）可知，回歸方程模型的P值均小于0.05，說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明失擬不顯著，模型的決定系數(shù)R2分別為0.971 1和0.905 7，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度高，因此該模型能夠很好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，占空比（X2）對(duì)總硫代葡萄糖苷含量影響極顯著（P＜0.01），對(duì)異硫氰酸酯含量影響顯著（P＜0.05），電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）對(duì)兩者影響均不顯著（P＞0.05）。因此，占空比對(duì)總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯含量的影響大于電場(chǎng)強(qiáng)度。

圖3 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜總硫代葡萄糖苷（A）和異硫氰酸酯（B）含量的影響Fig. 3 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of total glucosinolate (A) and isothiocyanate (B) in baby cabbage

2.2 MIPEF對(duì)抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD、POD和CAT活力

SOD、POD和CAT是植物中重要的抗氧化酶系，在抵御外界不良環(huán)境和衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由表2可知，除試驗(yàn)4外，SOD活力與對(duì)照組相比均有提高（2.22%～6.67%）；POD活力在試驗(yàn)2、3、6和9條件下活力顯著提高（P＜0.05），為對(duì)照組的1.07～1.38 倍；CAT活力較對(duì)照組則提高了5.28%～14.25%（除試驗(yàn)1、4、6和8）。根據(jù)中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)研究電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)SOD、POD和CAT活力的影響，結(jié)果如表3和圖4所示。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，SOD、POD和CAT的活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；而隨占空比的增加，3 種酶活力均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y7＝0.45＋0.037X1＋0.000 41X2＋0.000 15X1X2－0.021X12－6.68X22（SOD活力）、Y8＝25.79＋100.87X1－0.15X2＋0.24X1X2－40.83X12＋0.005 3X22（POD活力）和Y9＝52.91＋32.21X1＋0.31X2－0.099X1X2－13.93X12－0.000 52X22（CAT活力）。采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析（表3）可知，回歸方程模型的P值均小于0.05，說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2分別為0.900 7、0.968 6和0.941 5，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度高，因此該模型能夠很好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）和占空比（X2）對(duì)SOD活力均影響顯著（P＜0.05），且電場(chǎng)強(qiáng)度影響更大；電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）對(duì)POD活力影響顯著（P＜0.05），占空比（X2）影響極顯著（P＜0.01）；電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）和占空比（X2）對(duì)CAT活力影響顯著（P＜0.05），且占空比影響更大。

圖4 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活力的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the activities of SOD (A), POD (B)and CAT (C) in baby cabbage

2.2.2 GR和APX活力

抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)是植物體內(nèi)有效的活性氧清除系統(tǒng)，對(duì)園藝作物延緩衰老、延長(zhǎng)貨架期具有重要作用，GR和APX是該循環(huán)中兩種重要的酶，負(fù)責(zé)維持氧化還原平衡[30]。由表2可知，與對(duì)照組相比，GR活力在所有MIPEF處理?xiàng)l件下顯著增加（P＜0.05），提高幅度為6.22%～42.00%；除了試驗(yàn)4條件下，其他處理均使APX活力顯著提高（P＜0.05），提高幅度為2.00%～9.58%。根據(jù)中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)研究電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)GR和APX活性的影響，結(jié)果如表3和圖5所示。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，GR和APX活力均先上升后下降；隨占空比增加，GR活力呈下降趨勢(shì)，APX活力呈上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y11＝172.93＋65.98X1－0.26X2－0.30X1X2－24.50X12＋0.002 4X22（GR活力）和Y10＝782.04＋83.66X1＋2.41X2＋0.057X1X2－47.58X12－0.003 3X22（APX活力）。采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析（表3）可知，回歸方程模型的P值均小于0.05，說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2分別為0.911 1和0.970 0，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度高，因此該模型能夠很好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）和占空比（X2）對(duì)GR活力均影響顯著（P＜0.05），其中占空比影響更大；電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）和占空比（X2）對(duì)APX活力均影響極顯著（P＜0.01），其中電場(chǎng)強(qiáng)度影響更大。

圖5 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜GR（A）和APX（B）活力的影響Fig. 5 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the activities of GR (A) and APX (B) in baby cabbage

2.3 MIPEF對(duì)抗氧化能力的影響

2.3.2 總還原力

總還原力也是衡量植物組織抗氧化能力的重要指標(biāo)。由表2可知，除了試驗(yàn)1、4、8，其他條件下MIPEF處理均使總還原力顯著提升（P＜0.05），提高幅度為1.81%～12.66%。根據(jù)中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)研究電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)總還原力的影響，結(jié)果如表3和圖6D所示。總還原力隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加先上升后下降，隨占空比的增加則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方程如下：Y15＝5.44＋2.45X1－0.001 6X2＋0.010X1X2－1.31X12＋0.000 29X22。采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析（表3）可知，回歸方程模型的P值小于0.05，說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P值大于0.05，表明失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2為0.917 4，表明模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值擬合度較高，因此該模型能夠較好地預(yù)測(cè)和分析響應(yīng)值。另外，電場(chǎng)強(qiáng)度（X1）對(duì)總還原力影響顯著（P＜0.05）。

圖6 電場(chǎng)強(qiáng)度和占空比對(duì)娃娃菜DPPH自由基（A）、·OH（B）和O2－·（C）清除率以及總還原力（D）的影響Fig. 6 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on scavenging activity toward DPPH (A), ·OH (B)and O2-· (C) radicals, and total reducing power (D) in baby cabbage

2.4 MIPEF處理?xiàng)l件的優(yōu)化與驗(yàn)證

使用Design Expert軟件進(jìn)行條件優(yōu)化，設(shè)置各響應(yīng)值目標(biāo)和等級(jí)，得到最佳MIPEF處理?xiàng)l件為電場(chǎng)強(qiáng)度1.14 kV/cm、占空比46.40%，此時(shí)預(yù)測(cè)的各響應(yīng)值為總酚含量331.14 μg/g、花色苷含量84.08 μg/g、抗壞血酸含量35.78 mg/g、谷胱甘肽含量26.60 μg/g、總硫代葡萄糖苷含量2.28 μg/g、異硫氰酸酯含量14.00 μg/g、SOD活力0.48 U/g、POD活力104.94 U/g、CAT活力79.80 U/g、GR活力188.92 U/g、APX活力859.39 U/g、DPPH自由基清除率0.23 mg/g、·OH清除率1.04 mg/g、O－2·清除率1.69 mg/g、總還原力6.96 mg/g。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性和考慮實(shí)際情況，將最優(yōu)工藝修改為電場(chǎng)強(qiáng)度1.1 kV/cm、占空比46.4%，在此條件下平行實(shí)驗(yàn)3 次，得出各指標(biāo)為總酚含量321.25 μg/g、花色苷含量80.35 mg/g、抗壞血酸含量35.16 mg/g、谷胱甘肽含量23.65 μg/g、總硫代葡萄糖苷含量2.05 μg/g、異硫氰酸酯含量13.00 μg/g、SOD活力0.43 U/g、POD活力99.56 U/g、CAT活力71.35 U/g、GR活力195.34 U/g、APX活力834.32 U/g、DPPH自由基清除率0.23 mg/g、·OH清除率0.90 mg/g、O－2·清除率1.52 mg/g、總還原力6.65 mg/g。由此可見(jiàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值比較接近，達(dá)到預(yù)測(cè)值的88.91%～103.40%，表明預(yù)測(cè)結(jié)果較優(yōu)。

2.5 MIPEF處理的娃娃菜中活性物質(zhì)含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力的相關(guān)性

將MIPEF處理的娃娃菜中活性物質(zhì)含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，總酚含量與O－2·清除率和總還原力顯著相關(guān)（P＜0.05）；花色苷含量與·OH清除率和O－2·清除率顯著相關(guān)（P＜0.05）；抗壞血酸含量與DPPH自由基清除率以及總還原力極顯著相關(guān)（P＜0.01），與O－2·清除率顯著相關(guān)（P＜0.05）；異硫氰酸酯含量與DPPH自由基、·OH清除率和O－2·清除率均具有顯著相關(guān)性（P＜0.05、P＜0.01），與總還原力也顯著相關(guān)（P＜0.05）（圖7）。以上結(jié)果表明這些活性物質(zhì)的含量是影響娃娃菜抗氧化能力、貯藏品質(zhì)的重要因素。它們將與娃娃菜貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的自由基直接反應(yīng)對(duì)其清除，有效減少細(xì)胞損傷進(jìn)而延緩衰老進(jìn)程。然而高強(qiáng)度的PEF處理會(huì)促進(jìn)大孔隙的形成，將可逆滲透轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鎿舸?，加速植物組織的衰老[31]。在本實(shí)驗(yàn)中，電場(chǎng)強(qiáng)度從0.4 kV/cm提高至1.2 kV/cm時(shí)，所有活性物質(zhì)含量和抗氧化能力均顯著上升，但繼續(xù)提高至2.0 kV/cm后，活性物質(zhì)含量及抗氧化能力反而降低。這可能是因?yàn)? kV/cm超過(guò)了娃娃菜細(xì)胞膜能承受的臨界強(qiáng)度，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性甚至造成機(jī)械損傷，自由基產(chǎn)生的速率超過(guò)氧化防御系統(tǒng)清除自由基的速率，使得總體表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)[32]。除了MIPEF誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，也有研究認(rèn)為生物活性物質(zhì)含量的提高與MIPEF處理增加了細(xì)胞膜的滲透性有關(guān)。例如，Luengo等[33]用MIPEF處理（5 kV/cm、90 μs）番茄副產(chǎn)物后類(lèi)胡蘿卜素含量與對(duì)照組相比提高了39%。但Soliva-Fortuny等[5]研究認(rèn)為這種次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的提高更多地歸因于MIPEF的脅迫誘導(dǎo)，而非細(xì)胞膜透性增加導(dǎo)致的提取率提高。因?yàn)楫?dāng)施加電場(chǎng)強(qiáng)度為0.5 kV/cm時(shí)，葡萄中總酚提取率為24%，遠(yuǎn)高于電場(chǎng)強(qiáng)度為2.4 kV/cm時(shí)的提取率（14%）[34]。這也與本實(shí)驗(yàn)中電場(chǎng)強(qiáng)度提高至2 kV/cm后生物活性物質(zhì)含量反而降低一致。

圖7 MIPEF處理的娃娃菜中活性物質(zhì)含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力的Pearson相關(guān)性Fig. 7 Correlation analysis among the contents of bioactive compounds, the activities of antioxidant enzymes and antioxidant capacity in baby cabbage treated with MIPEF

3 討 論

自由基是果蔬在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種化學(xué)性質(zhì)活潑的代謝產(chǎn)物，主要分為活性氧和活性氮兩類(lèi)，構(gòu)成了果蔬的防御系統(tǒng)。在采后貯藏過(guò)程中，自由基堆積過(guò)量進(jìn)而引起氧化應(yīng)激，造成植物組織在分子水平和細(xì)胞水平上的各種損傷，加速衰老進(jìn)程。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，果蔬形成了一套清除自由基的自我保護(hù)系統(tǒng)，由非酶類(lèi)清除劑和酶類(lèi)清除劑組成：非酶類(lèi)清除劑一般包括黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素、抗壞血酸和還原型谷胱甘肽等活性物質(zhì)；酶類(lèi)清除劑則主要是抗氧化酶，如SOD、CAT、APX等。

在酶類(lèi)清除劑方面，MIPEF首先促使果蔬抗氧化系統(tǒng)的第一道防線SOD活力顯著提高（與對(duì)照組相比提高了2.22%～6.67%），可加速將O－2·歧化為H2O2和O2，同時(shí)阻止Fe3＋重新受超氧陰離子還原生成Fe2＋進(jìn)而催化形成毒性更強(qiáng)的·OH。另外，POD和CAT在經(jīng)MIPEF處理后活力也顯著提高（5.28%～38.45%），可將上一步反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2加速轉(zhuǎn)化為無(wú)毒性的H2O和O2，未反應(yīng)的H2O2則進(jìn)入谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)。MIPEF處理促使APX和GR活力分別上升2.00%～9.58%和6.22%～42.00%，促進(jìn)抗壞血酸和還原型谷胱甘肽的積累（圖8）。作為谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)的重要底物，谷胱甘肽和抗壞血酸含量的增加可促進(jìn)酶催化降解H2O2的速率產(chǎn)生無(wú)毒性的H2O和O2。MIPEF對(duì)酶活力的這種影響主要涉及焦耳熱損耗和電荷轉(zhuǎn)移引起的蛋白構(gòu)象變化[35]，并隨著酶分子結(jié)構(gòu)、食物基質(zhì)、溫度、處理裝置和設(shè)備參數(shù)等因素的不同，產(chǎn)生的影響也不同[8]。例如，Barbosa-Canovas等[36]發(fā)現(xiàn)液態(tài)蛋蛋白性質(zhì)不受脈沖電場(chǎng)影響，于電場(chǎng)強(qiáng)度26 kV/cm、方波脈沖數(shù)100下暴露2～4 μs，未見(jiàn)蛋白質(zhì)凝固；在48 kV/cm電場(chǎng)中，每單位體積10 個(gè)指數(shù)衰減脈沖的情況下，液態(tài)蛋的蛋白電泳模式未發(fā)生改變。而在其他研究中發(fā)現(xiàn)，MIPEF處理可通過(guò)改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)使某些酶降低或失去活性，例如多酚氧化酶[37]、果膠甲基酯酶[38]、木瓜蛋白酶[39]、血纖維蛋白溶酶[40]、脂肪酶[41]和蛋白酶[42]等。然而在某些情況下，MIPEF會(huì)促進(jìn)酶活力的提高。例如，陳敏[32]用MIPEF處理櫻桃番茄后，SOD和POD活力顯著上升，24～48 h后呈下降趨勢(shì)，但仍然高于對(duì)照組和不可逆電場(chǎng)組。許強(qiáng)等[43]的研究表明，1.0～6 kV/cm范圍的電場(chǎng)作用能使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生由β-折疊、β-轉(zhuǎn)角向α-螺旋及無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。在此情況下，可能使SOD和POD的活性中心暴露，提高與底物作用的幾率[32]，這可能也是本實(shí)驗(yàn)中抗氧化酶系活性提高的內(nèi)在機(jī)制。將抗氧化酶活力與抗氧化能力指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT活力與所有抗氧化能力指標(biāo)顯著相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）；POD活力與DPPH自由基、·OH清除率和O－2·清除率顯著相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）；APX活力與DPPH自由基、O－2·清除率和總還原力呈顯著相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）（圖7），表明抗氧化酶系活性提高是娃娃菜自由基清除能力提升，維持其貯藏品質(zhì)的重要因素。

圖8 MIPEF處理清除娃娃菜自由基的機(jī)制Fig. 8 Mechanism by which MIPEF scavenges free radicals in baby cabbage

綜上，MIPEF處理引起的非酶類(lèi)清除劑（生物活性物質(zhì)）和酶類(lèi)清除劑（抗氧化酶）活性的提高是清除娃娃菜自由基的潛在機(jī)制 。

4 結(jié) 論

MIPEF處理1 min后貯藏24 h，誘導(dǎo)娃娃菜產(chǎn)生應(yīng)激代謝響應(yīng)：一方面，刺激了總酚、花色苷、抗壞血酸、谷胱甘肽、總硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯等生物活性物質(zhì)的合成；另一方面，促進(jìn)了POD、SOD、CAT、APX等抗氧化酶系活力的提高。這兩方面作用促使娃娃菜的自由基清除能力提升，有效延緩了娃娃菜的衰老進(jìn)程，并增強(qiáng)了其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為1.1 kV/cm、占空比為46.4%時(shí)，MIPEF處理后娃娃菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化性能綜合評(píng)分最高。以上結(jié)果表明脈沖電場(chǎng)是一種極具潛力的果蔬非熱預(yù)處理方式，結(jié)合其在殺菌滅酶方面的表現(xiàn)，在果蔬提質(zhì)保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。