何坤明，王國(guó)錠，白新鵬，劉亞文，時(shí)振振，姜宗伯

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，海南省食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心，海南 ?？?570228）

山茱萸（Cornus officinalis）是我國(guó)著名的傳統(tǒng)藥用植物，分布在中國(guó)中部，如山西、河南、湖南等省份。其果肉傳統(tǒng)上被用作滋補(bǔ)消炎食品，可改善肝腎功能[1]，在中醫(yī)中被用于治療糖尿病、癌癥和休克[2]。山茱萸籽是山茱萸果實(shí)留下的果仁，富含多糖、蛋白質(zhì)和油脂等成分。目前為止，山茱萸籽利用率極低，且對(duì)山茱萸籽多糖的研究報(bào)道較少。

多糖是10 個(gè)或10 個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵縮聚而成的聚合物[3]，主要存在于動(dòng)植物的體內(nèi)和微生物的細(xì)胞壁中。它們分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖[4]。隨著工業(yè)的發(fā)展，多糖被廣泛應(yīng)用于食品[5]、醫(yī)藥[6]、材料領(lǐng)域[7]。幾十年來(lái)，多糖以其生物調(diào)節(jié)和生物活性吸引了生物學(xué)家，包括免疫[8]、抗氧化[9]、抗腫瘤[10]和降低血糖活性[11]。一般認(rèn)為，與化學(xué)合成的抗氧化劑相比，大量的天然多糖一般具有良好的生物相容性、生物降解性和無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)[12]。研究表明，過(guò)量活性氧引起的氧化應(yīng)激可引起多種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，如糖尿病、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥和帕金森氏癥[13]。據(jù)報(bào)道，天然多糖通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生而有利于抗氧化應(yīng)激[14]。因此，從食品工業(yè)的自然資源中發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)具有抗氧化能力的多糖具有重要意義[15]。

多糖的提取、分離和純化是研究多糖結(jié)構(gòu)和活性的基礎(chǔ)，只有得到相對(duì)純度較高的多糖組分，才能更好地分析其結(jié)構(gòu)，從而探究其重要的生理功能。多糖結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，多糖的結(jié)構(gòu)分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化學(xué)的核心所在。本實(shí)驗(yàn)采用亞臨界水萃取技術(shù)對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行提取，亞臨界水是指溫度介于沸點(diǎn)和臨界溫度之間，維持適當(dāng)壓力使水保持為液體狀態(tài)的水[16]，作為一種新型綠色提取技術(shù)，與傳統(tǒng)水提取法[17]、超聲波輔助提取法[18]、酸堿提取法相比，亞臨界水提取法具有綠色環(huán)保、得率高、省時(shí)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前在多糖、多酚、黃酮和花青素等天然產(chǎn)物提取方面得到廣泛應(yīng)用[19]。通過(guò)對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)特征及抗氧化性活性進(jìn)行研究，旨在為山茱萸籽多糖的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。為進(jìn)一步對(duì)山茱萸籽多糖開(kāi)發(fā)為功能性食品及解析多糖構(gòu)效關(guān)系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸籽購(gòu)于河南南陽(yáng)宛西制藥廠。

無(wú)水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O2、葡萄糖、氫氧化鈉、氯化鈉 西隴科學(xué)股份有限公司；沒(méi)食子酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%濃硫酸、苯酚 廣州化學(xué)試劑廠；福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。單糖標(biāo)準(zhǔn)品（甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)uc）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）和木糖（xylose，Xyl））（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HT-500FC型亞臨界水設(shè)備 上?；敉?shí)驗(yàn)儀器有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；T27型傅里葉變換紅外光譜儀、500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀 德國(guó)布魯克公司；NW10VF型超純水系統(tǒng) 上海力康生物科技有限公司；FDU-2100型冷凍干燥機(jī) 上海埃朗科技國(guó)際貿(mào)易有限公司；1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；Verios G4掃描電子顯微鏡 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）上海沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸籽多糖的萃取

山茱萸籽經(jīng)80 ℃干燥24 h后，研磨機(jī)研磨，過(guò)60 目篩，備用。稱取10 g山茱萸籽粉，采用亞臨界水設(shè)備萃取，萃取條件為：萃取溫度160 ℃；萃取時(shí)間20 min；料液比為1∶40（m/V）[20]。萃取完成后，用冷水快速冷卻萃取液。萃取液濃縮，8 000 r/min離心10 min，去除沉淀。上清液中加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃放置12 h后，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥，得山茱萸籽粗多糖，多糖得率（山茱萸籽多糖質(zhì)量/山茱萸籽質(zhì)量）可達(dá)（17.25±0.15）%。

1.3.2 山茱萸籽多糖脫色、脫蛋白

稱取500 mg山茱萸籽粗多糖，溶于蒸餾水中配制成5 mg/mL山茱萸籽多糖溶液，加入5 mL 30% H2O2[21]，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9，在40 ℃下水浴1 h進(jìn)行脫色，6 000 r/min離心5 min得澄清透明粗多糖溶液。

脫色后的多糖溶液加入1/2體積的Sevag試劑（氯仿與正丁醇體積比為4∶1）脫除蛋白質(zhì)[22]，劇烈振蕩20 min，移入分液漏斗中靜置20 min，棄去中間蛋白層與下層物質(zhì)，多次重復(fù)上述步驟至觀察到無(wú)明顯的中間蛋白層，100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮多糖溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，透析袋外液為500 mL蒸餾水，每隔12 h更換一次蒸餾水，從而除去多糖溶液中的鹽類及小分子雜質(zhì)。透析后將多糖溶液冷凍干燥，即可獲得山茱萸籽多糖，多糖回收率（純化后山茱萸籽多糖質(zhì)量/粗山茱萸籽多糖質(zhì)量）為（72.14±0.41）%。

1.3.3 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖

采用DEAE-52纖維素柱對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行分離純化[23]。稱取500 mg山茱萸籽多糖樣品，溶于50 mL蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，0.45 μm過(guò)濾膜過(guò)濾，每次上樣體積5 mL，上樣至DEAE-52纖維素柱，用蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液以1.0 mL/min的流速逐步洗脫。采用自動(dòng)餾分收集器每管收集5 mL餾分。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用苯酚-硫酸法[24]測(cè)定多糖餾分490 nm處的吸光度A490nm。合并同一吸收峰洗脫液，共得到5 個(gè)多糖組分（COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5），100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液冷凍干燥到5 個(gè)多糖組分。

1.3.4 葡聚糖凝膠柱層析純化山茱萸籽多糖組分

采用Sephadex G-100對(duì)主要餾分COSP-4進(jìn)一步分離純化：層析柱規(guī)格為1.6 cm×50 cm；上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL；上樣體積4 mL；蒸餾水洗脫，流速為0.4 mL/min；采用自動(dòng)餾分收集器每管收集2 mL餾分。采用苯酚-硫酸法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每管洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線，根據(jù)出峰位置收集主要餾分COSP-4，100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液凍干得到多糖純化組分COSP-4。

1.3.5 多糖組分的純度鑒定

采用紫外光譜分析多糖組分純度，將山茱萸籽粗多糖及純化組分COSP-4分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，以水作為空白對(duì)照，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，確定山茱萸籽多糖樣品特征吸收峰，同時(shí)檢測(cè)多糖組分中是否有蛋白質(zhì)及核酸殘留。

1.3.6 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

多糖的均一性和分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法[25]，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)配備折射率檢測(cè)器和超水凝膠線性凝膠過(guò)濾色譜柱。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將山茱萸籽多糖純化組分COSP-4和KBr按質(zhì)量比1∶40混合研磨，壓片機(jī)壓片。樣品測(cè)試前進(jìn)行背景掃描去除干擾，在4 000～500 cm－1的條件下，測(cè)定多糖的有機(jī)官能團(tuán)。

1.3.8 單糖組成的測(cè)定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化和LC-MS檢測(cè)分析單糖組成[26]。取10 mg樣品，用5 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）在100 ℃下水解2 h，冷卻后打開(kāi)蓋，取1 mL水解后樣品溶液加入1 mL無(wú)水甲醇，70 ℃水浴下用N2吹干，如此重復(fù)加無(wú)水甲醇并用N2吹干2 次，以去除TFA；分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL 0.5mol/L的PMP-無(wú)水甲醇溶液，漩渦混勻，于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h；取出放置冷卻至室溫，加400 μL 0.3 mol/L HCl中和（pH 6～7）；加1 200 μL去離子水，再加等體積的氯仿，漩渦混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔濾膜（水系）過(guò)濾后待進(jìn)樣分析。色譜條件：色譜柱：EC-C18柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A：20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（pH 7.0）；流動(dòng)相B：乙腈；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。MS掃描條件：特征離子掃描模式；正離子模式電噴霧離子源電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣（N2）流速1 000 L/h；特征離子m/z：481.09、495.1、510.1、511.08、525.06。通過(guò)比較樣品與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的保留時(shí)間，確定單糖組成。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

用掃描電子顯微鏡對(duì)多糖的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。取適當(dāng)?shù)臉悠凡じ皆趻呙桦娮语@微鏡樣品盤上。用粉塵球吹走多余的樣品，并噴金，觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.10 甲基化反應(yīng)及氣相色譜-質(zhì)譜分析單糖殘基連接方式

樣品衍生化：稱取10 mg山茱萸籽多糖COSP-4樣品，加入1 mL蒸餾水溶解，加入1 mL 100 mg/mL碳二亞胺，反應(yīng)2 h。加入1 mL 2 mol/L的咪唑，將樣品平均分為2 份，分別加入1 mL 30 mg/mL的NaBH4和1 mL 30 mg/mL的NaBD4，反應(yīng)3 h，加入100 μL冰醋酸終止反應(yīng)。透析樣品48 h，透析完成后冷凍干燥樣品，進(jìn)行甲基化處理。凍干樣品中加入500 μL 二甲基亞砜溶解，加入1 mg NaOH，孵育30 min，加入50 μL碘甲烷溶液反應(yīng)1 h，加入1 mL去離子水和2 mL二氯甲烷，漩渦混勻，6 000 r/min離心10 min，棄去上層水相，重復(fù)水洗3 次，吸取下層二氯甲烷相并蒸干。加入100 μL 2 mol/L TFA，121 ℃反應(yīng)90 min，30 ℃蒸干，加入50 μL 2 mol/L氨水和50 μL 1 mol/L NaBD4，混勻后室溫反應(yīng)2.5 h。加入20 μL乙酸終止反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑?50 μL無(wú)水甲醇洗兩次，氮?dú)獯蹈?。加?50 μL乙酸酐，漩渦混勻，100 ℃反應(yīng)2.5 h。加入1 mL超純水靜置10 min，加入500 μL二氯甲烷，渦旋混勻，6 000 r/min離心10 min，棄水相，重復(fù)水洗3 次，取下層二氯甲烷相，上機(jī)檢測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜分析（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：GC條件：進(jìn)樣量為1 μL，分流比10∶1，載氣為高純氦氣；柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2.0 min，以3 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持3 min；MS條件：質(zhì)譜系統(tǒng)采用的是美國(guó)Aiglent公司的四極桿質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，配有電子轟擊離子源和MassHunter工作站。采用電子轟擊離子源全掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：30～600。

1.3.11 核磁共振波譜分析多糖糖苷鍵的構(gòu)型

稱取50 mg樣品溶解在D2O中。使用500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀，在25 ℃記錄核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的1H-NMR譜圖和13C-NMR譜圖。

1.3.12 DPPH自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27]稍作修改，對(duì)COSP-4的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。將溶解于乙醇中的3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入至2 mL不同質(zhì)量濃度（1.0～5.0 mg/mL）的COSP-4溶液中，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。無(wú)DPPH的反應(yīng)混合物作為對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度；A1為樣品與DPPH溶液的吸光度；A2為無(wú)DPPH的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

1.3.13 羥自由基清除率的測(cè)定

取0.2 mL不同質(zhì)量濃度的COSP-4（1.0～5.0 mg/mL）與1 mL 6 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液混合。混合溶液在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[28]。以無(wú)H2O2溶液的反應(yīng)混合物作為對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。按式（2）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液的吸光度，A1為樣品組混合溶液吸光度，A2為無(wú)H2O2溶液的反應(yīng)混合物溶液的吸光度。

1.3.14 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[29]稍作修改，測(cè)定COSP-4的2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除率。0.384 g ABTS和0.066 g過(guò)硫酸鉀溶解在100 mL蒸餾水中，室溫下避光反應(yīng)12 h，得到ABTS溶液。將10 mL ABTS溶液用pH 7.4 0.01 mol/L磷酸緩沖液稀釋50 倍，使734 nm波長(zhǎng)處吸光度約為0.7。將1 mL COSP-4溶液（1.0～5.0 mg/mL）與1 mL蒸餾水和2 mL ABTS工作液混合，充分混勻后室溫避光10 min，在734 nm處測(cè)定吸光度。未加入ABTS的反應(yīng)混合物作為對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照按公式（3）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

式中：A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為無(wú)ABTS的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.6軟件、MestReNova軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖的結(jié)果

DEAE-52纖維素柱為陰離子交換層析柱，能根據(jù)樣品所帶電荷的強(qiáng)弱將其分成不同的組分。由圖1可知，經(jīng)過(guò)蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，得到5 個(gè)多糖組分（COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5）。收集含量最高的多糖組分COSP-4，濃縮后透析，凍干得白色粉末，為山茱萸籽多糖初步分離純化組分COSP-4，回收率為20%左右。

圖1 山茱萸籽多糖的DEAE-52柱層析洗脫圖Fig. 1 DEAE-52 anion-exchange column chromatography elution curve of Cornus officinalis seed polysaccharides

2.2 葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果

凝膠色譜柱是根據(jù)分子質(zhì)量大小對(duì)樣品進(jìn)行分離純化，分子質(zhì)量大的分子先流出色譜柱，分子質(zhì)量小的后流出，從而達(dá)到分離效果[30]。利用Sephadex G-100對(duì)經(jīng)過(guò)離子交換柱初步分離的山茱萸籽多糖COSP-4組分進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

如圖2所示，用Sephadex G-100純化后的COSP-4為單峰，表明多糖樣品純度較高，為均一組分。主要餾分收集、濃縮、透析，凍干得精制的山茱萸籽多糖組分COSP-4呈白色粉末狀，回收率為70%。

圖2 COSP-4組分的Sephadex G-100柱層析洗脫圖Fig. 2 Sephadex G-100 column chromatography elution curve of COSP-4

2.3 多糖組分COSP-4的純度鑒定結(jié)果

在紫外吸收光譜圖中，溶液在200 nm～300 nm范圍內(nèi)的吸收峰可以驗(yàn)證多糖中是否含大量的蛋白質(zhì)及核酸[31]，從圖3可以看出，山茱萸籽粗多糖在280 nm處有明顯的吸收峰；而COSP-4在260 nm和280 nm處無(wú)明顯的吸收峰，初步表明純化多糖COSP-4幾乎不含蛋白質(zhì)與核酸，多糖純度較高。

圖3 COSP-4組分的紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectra of the crude polysaccharide and COSP-4

2.4 多糖分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

分子質(zhì)量是多糖的重要結(jié)構(gòu)指標(biāo)，影響多糖的理化和生物活性等性質(zhì)。采用HPGPC法測(cè)定COSP-4的平位均分子質(zhì)量。COSP-4的分子質(zhì)量約為2.03×104Da。峰位分子質(zhì)量（mp）為20 279 Da，重均分子質(zhì)量（mw）為17 359 Da，數(shù)均分子質(zhì)量（mn）為14 566 Da。多分散性指數(shù)（mw/mn）為1.191，接近1，說(shuō)明COSP-4的平均分子質(zhì)量分布較集中，結(jié)合葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果分析表明COSP-4純度較高。

2.5 COSP-4紅外光譜分析結(jié)果

如圖4所示，COSP-4的紅外光譜圖在3 442 cm－1附近出現(xiàn)了寬而強(qiáng)烈的吸收峰，表明氫鍵中存在羥基伸長(zhǎng)[32]。在2 927 cm－1附近的吸收峰是—CH3或—CH2—的弱C－H鍵的伸縮振動(dòng)所致[33]。1 637 cm－1和1 440 cm－1處的兩個(gè)峰分別是羧酸基的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起[34]。這證實(shí)了在COSP-4中存在糖醛酸，與單糖組成分析結(jié)果一致。同時(shí)，在1 730 cm－1附近沒(méi)有明顯的吸收峰，說(shuō)明COSP-4中的葡萄糖醛酸沒(méi)有酯化[35]。1 382 cm－1處的弱吸收峰為烷基的C－H變角振動(dòng)吸收峰。在1 103 cm－1附近的弱吸收峰是吡喃環(huán)骨架的C－O變角振動(dòng)吸收峰，表明分子中存在C－O－H和C－O－C結(jié)構(gòu)[36]。在777 cm－1處存在弱吸收峰，推測(cè)含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，其他結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖4 COSP-4的傅里葉變換紅外吸收光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectrum of COSP-4

2.6 單糖組成分析結(jié)果

單糖組成分析在植物多糖的結(jié)構(gòu)與功效、中藥材的檢測(cè)與鑒定等方面有著十分重要的作用[37]。實(shí)驗(yàn)采用LC-MS分析COSP-4的單糖組成。

如圖5所示，Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Fuc出峰時(shí)間依次為5.18、6.37、7.53、7.85、8.59、9.14、9.56、10.50 min，出峰分離度較好，無(wú)干擾現(xiàn)象，可作為多糖單糖組成進(jìn)一步分析的依據(jù)。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品與COSP-4保留時(shí)間確定單糖種類，根據(jù)各峰面積比計(jì)算單糖的物質(zhì)的量之比。COSP-4是一種由6 種單糖組成的酸性多糖。由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成，物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70，其中Xyl含量最高。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和COSP-4樣品（B）的單糖組成LC-MS圖Fig. 5 Liquid chromatograph-mass spectrometry chromatograms of mixed monosaccharide standard (A) and monosaccharide composition of COSP-4 (B)

2.7 COSP-4的微觀結(jié)構(gòu)

如圖6A所示，在5 000 倍下山茱萸籽多糖純化組分COSP-4主要是由不規(guī)則和支離破碎的結(jié)構(gòu)組成，并穿插帶有一些小的不規(guī)則顆粒，表面有碎片，為粗糙片狀。如圖6B所示，在30 000 倍下觀察到COSP-4疏松多孔，類似于海綿結(jié)構(gòu)，多糖結(jié)構(gòu)表面粗糙，結(jié)構(gòu)松散。其結(jié)構(gòu)與山茱萸果肉多糖結(jié)構(gòu)[38]較為相似，均呈不規(guī)則形狀。

圖6 COSP-4的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 SEM images of COSP-4

2.8 COSP-4單糖殘基連接方式分析結(jié)果

甲基化分析是測(cè)定多糖糖鏈中各種單糖殘基連接方式的重要手段之一。甲基化反應(yīng)是用甲基取代多糖上連接的羥基，然后完全酸水解取代后的產(chǎn)物，最后將水解產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，獲得不同甲基化的單糖及其比例關(guān)系。如表1所示，在COSP-4中檢測(cè)到14 種甲基化糖，結(jié)果表明山茱萸籽多糖純化組分COSP-4中含量最高單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?；?2,3-二甲基木糖，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為37.98%，其次為1,5-二乙?；?2,3,4-三甲基木糖，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為18.30%。實(shí)驗(yàn)對(duì)山茱萸籽多糖純化組分COSP-4鏈狀結(jié)構(gòu)主要成分進(jìn)行了初步確定，為山茱萸籽多糖主鏈、側(cè)鏈的確定及三維空間結(jié)構(gòu)探索奠定一定的基礎(chǔ)。

表1 COSP-4的甲基化反應(yīng)及GC-MS分析數(shù)據(jù)Table1 Methylation reaction and gas chromatography-mass spectrometry analysis of COSP-4

2.9 COSP-4核磁共振波譜分析結(jié)果

糖苷鍵的構(gòu)型和異頭碳在多糖結(jié)構(gòu)中的構(gòu)型可用一維核磁共振（1H-NMR和13C-NMR）技術(shù)分析。1H-NMR主要用于解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)，不規(guī)則質(zhì)子殘留在δ5.00以上的質(zhì)子在α構(gòu)型中有化學(xué)置換，而低于δ5.00的質(zhì)子在β構(gòu)型中有化學(xué)置換。因此，這兩種糖可以通過(guò)δ值來(lái)區(qū)分。COSP-4的一維核磁（1H和13C）光譜如圖7所示。如圖7A所示，在COSP-4的1H-NMR譜中分別出現(xiàn)6 個(gè)1H信號(hào)，分別為δ5.75、5.24、5.12、5.06、4.89、4.45，表明COSP-4中的殘基同時(shí)包含了α構(gòu)型糖基和β構(gòu)型糖基[39]，同時(shí)表明，COSP-4中有6 種糖殘基，與單糖組成及甲基化反應(yīng)對(duì)應(yīng)的GC-MS分析結(jié)果一致。

與1H-NMR相比，13C-NMR化學(xué)位移范圍寬廣，分辨率高，可以解析異頭碳的構(gòu)型，多糖殘基中取代位點(diǎn)和分支點(diǎn)。在13C-NMR波譜中，在區(qū)域內(nèi)的共振被指定為異頭碳原子。在鄰域δ101.69處有1 個(gè)異頭碳信號(hào)，屬于1 個(gè)異頭碳?xì)埢腃1。一般來(lái)說(shuō)，與α構(gòu)型連接的C1化學(xué)位移比β構(gòu)型低δ1.5～3.0，α構(gòu)型的化學(xué)位移是δ97～101，β構(gòu)型是δ103～105。從圖7B中可以看出，在COSP-4中主要存在有α構(gòu)型糖基。C2～C5信號(hào)的δ值均集中在δ70～77之間，說(shuō)明其中大部分尚未被取代。在δ60～70之間都有化學(xué)位移，說(shuō)明C6位置羥基一部分發(fā)生取代，一部分未發(fā)生取代。此外，δ16.57處的化學(xué)位移是由于鼠李糖的C6。

圖7 COSP-4的1H-NMR譜圖（A）和13C-NMR譜圖（B）Fig. 7 1H-NMR spectrum (A) and 13C-NMR spectrum (B) of COSP-4

2.10 COSP-4的抗氧化活性

如圖8A所示，當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從0增加到3.0 mg/mL時(shí)，COSP-4對(duì)DDPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從3.0 mg/mL提高到5.0 mg/mL時(shí)，DDPH自由基的清除能力增長(zhǎng)較為緩慢。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，COSP-4的DPPH自由基的清除率達(dá)到68.61%，5.0 mg/mL VC的DPPH自由基清除率高達(dá)99.60%。COSP-4和VC的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（1.72±0.14）mg/mL和（0.49±0.04）mg/mL。

圖8 COSP-4的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activity of COSP-4

如圖8B所示，COSP-4對(duì)羥自由基具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，COSP-4清除羥自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL后，羥自由基清除率增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩。COSP-4和VC的IC50分別為（1.48±0.17）mg/mL和（0.50±0.02）mg/mL。5.0 mg/mL VC的羥自由基清除能率可達(dá)99.8%，相同質(zhì)量濃度的COSP-4羥自由基清除率為72.24%。在之前的研究報(bào)道中，在質(zhì)量濃度為21.1 mg/mL的槐根多糖中羥自由基清除率74.02%[40]，在0.3 mg/mL苦瓜多糖中，羥自由基清除率為63.92%[41]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山茱萸籽多糖COSP-4具有相對(duì)較好的清除羥自由基活性。

如圖8C所示，在質(zhì)量濃度0～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，COSP-4對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。COSP-4和VC的IC50分別為（2.87±0.27）mg/mL和（0.50±0.06）mg/mL。在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，COSP-4、VC的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率分別為61.68%、99.80%。

3 結(jié) 論

本研究成功地從山茱萸籽中分離純化了一種主要的多糖組分COSP-4，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、抗氧化活性進(jìn)行了研究分析。結(jié)果表明，山茱萸籽多糖組分COSP-4是分子質(zhì)量約為2.03×104Da的酸性多糖，由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成，物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70。包含14 種甲基化糖，含量最高的單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?；?2,3-二甲基木糖，具有良好的羥自由基、DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，有望在天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)等方面得到應(yīng)用，同時(shí)在醫(yī)藥和功能食品中具有廣闊的應(yīng)用前景。