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        山茱萸籽多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性

        2021-10-31 11:19:04何坤明王國(guó)錠白新鵬劉亞文時(shí)振振姜宗伯
        食品科學(xué) 2021年19期
        關(guān)鍵詞:山茱萸單糖清除率

        何坤明,王國(guó)錠,白新鵬,劉亞文,時(shí)振振,姜宗伯

        (海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南省食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南省南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心,海南 ???570228)

        山茱萸(Cornus officinalis)是我國(guó)著名的傳統(tǒng)藥用植物,分布在中國(guó)中部,如山西、河南、湖南等省份。其果肉傳統(tǒng)上被用作滋補(bǔ)消炎食品,可改善肝腎功能[1],在中醫(yī)中被用于治療糖尿病、癌癥和休克[2]。山茱萸籽是山茱萸果實(shí)留下的果仁,富含多糖、蛋白質(zhì)和油脂等成分。目前為止,山茱萸籽利用率極低,且對(duì)山茱萸籽多糖的研究報(bào)道較少。

        多糖是10 個(gè)或10 個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵縮聚而成的聚合物[3],主要存在于動(dòng)植物的體內(nèi)和微生物的細(xì)胞壁中。它們分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖[4]。隨著工業(yè)的發(fā)展,多糖被廣泛應(yīng)用于食品[5]、醫(yī)藥[6]、材料領(lǐng)域[7]。幾十年來(lái),多糖以其生物調(diào)節(jié)和生物活性吸引了生物學(xué)家,包括免疫[8]、抗氧化[9]、抗腫瘤[10]和降低血糖活性[11]。一般認(rèn)為,與化學(xué)合成的抗氧化劑相比,大量的天然多糖一般具有良好的生物相容性、生物降解性和無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)[12]。研究表明,過(guò)量活性氧引起的氧化應(yīng)激可引起多種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,如糖尿病、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥和帕金森氏癥[13]。據(jù)報(bào)道,天然多糖通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生而有利于抗氧化應(yīng)激[14]。因此,從食品工業(yè)的自然資源中發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)具有抗氧化能力的多糖具有重要意義[15]。

        多糖的提取、分離和純化是研究多糖結(jié)構(gòu)和活性的基礎(chǔ),只有得到相對(duì)純度較高的多糖組分,才能更好地分析其結(jié)構(gòu),從而探究其重要的生理功能。多糖結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ),多糖的結(jié)構(gòu)分析在多糖的研究中具有非常重要的地位,是糖化學(xué)的核心所在。本實(shí)驗(yàn)采用亞臨界水萃取技術(shù)對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行提取,亞臨界水是指溫度介于沸點(diǎn)和臨界溫度之間,維持適當(dāng)壓力使水保持為液體狀態(tài)的水[16],作為一種新型綠色提取技術(shù),與傳統(tǒng)水提取法[17]、超聲波輔助提取法[18]、酸堿提取法相比,亞臨界水提取法具有綠色環(huán)保、得率高、省時(shí)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),目前在多糖、多酚、黃酮和花青素等天然產(chǎn)物提取方面得到廣泛應(yīng)用[19]。通過(guò)對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)特征及抗氧化性活性進(jìn)行研究,旨在為山茱萸籽多糖的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。為進(jìn)一步對(duì)山茱萸籽多糖開(kāi)發(fā)為功能性食品及解析多糖構(gòu)效關(guān)系提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        山茱萸籽購(gòu)于河南南陽(yáng)宛西制藥廠。

        無(wú)水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O2、葡萄糖、氫氧化鈉、氯化鈉 西隴科學(xué)股份有限公司;沒(méi)食子酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%濃硫酸、苯酚 廣州化學(xué)試劑廠;福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司;以上試劑均為分析純。單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖(mannose,Man)、果糖(fructose,F(xiàn)uc)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、葡萄糖(glucose,Glc)、半乳糖(galactose,Gal)和木糖(xylose,Xyl))(色譜純) 上海源葉生物科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        HT-500FC型亞臨界水設(shè)備 上?;敉?shí)驗(yàn)儀器有限公司;GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;T27型傅里葉變換紅外光譜儀、500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀 德國(guó)布魯克公司;NW10VF型超純水系統(tǒng) 上海力康生物科技有限公司;FDU-2100型冷凍干燥機(jī) 上海埃朗科技國(guó)際貿(mào)易有限公司;1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;Verios G4掃描電子顯微鏡 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)上海沃特世科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 山茱萸籽多糖的萃取

        山茱萸籽經(jīng)80 ℃干燥24 h后,研磨機(jī)研磨,過(guò)60 目篩,備用。稱取10 g山茱萸籽粉,采用亞臨界水設(shè)備萃取,萃取條件為:萃取溫度160 ℃;萃取時(shí)間20 min;料液比為1∶40(m/V)[20]。萃取完成后,用冷水快速冷卻萃取液。萃取液濃縮,8 000 r/min離心10 min,去除沉淀。上清液中加入4 倍體積的無(wú)水乙醇,4 ℃放置12 h后,8 000 r/min離心10 min,收集沉淀,冷凍干燥,得山茱萸籽粗多糖,多糖得率(山茱萸籽多糖質(zhì)量/山茱萸籽質(zhì)量)可達(dá)(17.25±0.15)%。

        1.3.2 山茱萸籽多糖脫色、脫蛋白

        稱取500 mg山茱萸籽粗多糖,溶于蒸餾水中配制成5 mg/mL山茱萸籽多糖溶液,加入5 mL 30% H2O2[21],用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9,在40 ℃下水浴1 h進(jìn)行脫色,6 000 r/min離心5 min得澄清透明粗多糖溶液。

        脫色后的多糖溶液加入1/2體積的Sevag試劑(氯仿與正丁醇體積比為4∶1)脫除蛋白質(zhì)[22],劇烈振蕩20 min,移入分液漏斗中靜置20 min,棄去中間蛋白層與下層物質(zhì),多次重復(fù)上述步驟至觀察到無(wú)明顯的中間蛋白層,100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮多糖溶液至50 mL左右,裝入透析袋透析48 h,透析袋外液為500 mL蒸餾水,每隔12 h更換一次蒸餾水,從而除去多糖溶液中的鹽類及小分子雜質(zhì)。透析后將多糖溶液冷凍干燥,即可獲得山茱萸籽多糖,多糖回收率(純化后山茱萸籽多糖質(zhì)量/粗山茱萸籽多糖質(zhì)量)為(72.14±0.41)%。

        1.3.3 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖

        采用DEAE-52纖維素柱對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行分離純化[23]。稱取500 mg山茱萸籽多糖樣品,溶于50 mL蒸餾水中,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液,0.45 μm過(guò)濾膜過(guò)濾,每次上樣體積5 mL,上樣至DEAE-52纖維素柱,用蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液以1.0 mL/min的流速逐步洗脫。采用自動(dòng)餾分收集器每管收集5 mL餾分。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,用苯酚-硫酸法[24]測(cè)定多糖餾分490 nm處的吸光度A490nm。合并同一吸收峰洗脫液,共得到5 個(gè)多糖組分(COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5),100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右,裝入透析袋透析48 h,具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液冷凍干燥到5 個(gè)多糖組分。

        1.3.4 葡聚糖凝膠柱層析純化山茱萸籽多糖組分

        采用Sephadex G-100對(duì)主要餾分COSP-4進(jìn)一步分離純化:層析柱規(guī)格為1.6 cm×50 cm;上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL;上樣體積4 mL;蒸餾水洗脫,流速為0.4 mL/min;采用自動(dòng)餾分收集器每管收集2 mL餾分。采用苯酚-硫酸法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每管洗脫液的吸光度,繪制洗脫曲線,根據(jù)出峰位置收集主要餾分COSP-4,100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右,裝入透析袋透析48 h,具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液凍干得到多糖純化組分COSP-4。

        1.3.5 多糖組分的純度鑒定

        采用紫外光譜分析多糖組分純度,將山茱萸籽粗多糖及純化組分COSP-4分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液,以水作為空白對(duì)照,在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描,確定山茱萸籽多糖樣品特征吸收峰,同時(shí)檢測(cè)多糖組分中是否有蛋白質(zhì)及核酸殘留。

        1.3.6 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

        多糖的均一性和分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)法[25],高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng)配備折射率檢測(cè)器和超水凝膠線性凝膠過(guò)濾色譜柱。

        1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

        將山茱萸籽多糖純化組分COSP-4和KBr按質(zhì)量比1∶40混合研磨,壓片機(jī)壓片。樣品測(cè)試前進(jìn)行背景掃描去除干擾,在4 000~500 cm-1的條件下,測(cè)定多糖的有機(jī)官能團(tuán)。

        1.3.8 單糖組成的測(cè)定

        采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone,PMP)柱前衍生化和LC-MS檢測(cè)分析單糖組成[26]。取10 mg樣品,用5 mL 2 mol/L三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)在100 ℃下水解2 h,冷卻后打開(kāi)蓋,取1 mL水解后樣品溶液加入1 mL無(wú)水甲醇,70 ℃水浴下用N2吹干,如此重復(fù)加無(wú)水甲醇并用N2吹干2 次,以去除TFA;分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中,加400 μL 0.5mol/L的PMP-無(wú)水甲醇溶液,漩渦混勻,于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h;取出放置冷卻至室溫,加400 μL 0.3 mol/L HCl中和(pH 6~7);加1 200 μL去離子水,再加等體積的氯仿,漩渦混勻振搖,靜置,棄去氯仿相,如此萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔濾膜(水系)過(guò)濾后待進(jìn)樣分析。色譜條件:色譜柱:EC-C18柱(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);流動(dòng)相A:20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(pH 7.0);流動(dòng)相B:乙腈;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。MS掃描條件:特征離子掃描模式;正離子模式電噴霧離子源電壓2.0 kV;錐孔電壓30 V;離子源溫度150 ℃;脫溶劑溫度500 ℃;脫溶劑氣(N2)流速1 000 L/h;特征離子m/z:481.09、495.1、510.1、511.08、525.06。通過(guò)比較樣品與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的保留時(shí)間,確定單糖組成。

        1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

        用掃描電子顯微鏡對(duì)多糖的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。取適當(dāng)?shù)臉悠凡じ皆趻呙桦娮语@微鏡樣品盤上。用粉塵球吹走多余的樣品,并噴金,觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

        1.3.10 甲基化反應(yīng)及氣相色譜-質(zhì)譜分析單糖殘基連接方式

        樣品衍生化:稱取10 mg山茱萸籽多糖COSP-4樣品,加入1 mL蒸餾水溶解,加入1 mL 100 mg/mL碳二亞胺,反應(yīng)2 h。加入1 mL 2 mol/L的咪唑,將樣品平均分為2 份,分別加入1 mL 30 mg/mL的NaBH4和1 mL 30 mg/mL的NaBD4,反應(yīng)3 h,加入100 μL冰醋酸終止反應(yīng)。透析樣品48 h,透析完成后冷凍干燥樣品,進(jìn)行甲基化處理。凍干樣品中加入500 μL 二甲基亞砜溶解,加入1 mg NaOH,孵育30 min,加入50 μL碘甲烷溶液反應(yīng)1 h,加入1 mL去離子水和2 mL二氯甲烷,漩渦混勻,6 000 r/min離心10 min,棄去上層水相,重復(fù)水洗3 次,吸取下層二氯甲烷相并蒸干。加入100 μL 2 mol/L TFA,121 ℃反應(yīng)90 min,30 ℃蒸干,加入50 μL 2 mol/L氨水和50 μL 1 mol/L NaBD4,混勻后室溫反應(yīng)2.5 h。加入20 μL乙酸終止反應(yīng),氮?dú)獯蹈桑?50 μL無(wú)水甲醇洗兩次,氮?dú)獯蹈?。加?50 μL乙酸酐,漩渦混勻,100 ℃反應(yīng)2.5 h。加入1 mL超純水靜置10 min,加入500 μL二氯甲烷,渦旋混勻,6 000 r/min離心10 min,棄水相,重復(fù)水洗3 次,取下層二氯甲烷相,上機(jī)檢測(cè)。

        氣相色譜-質(zhì)譜分析(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS):GC條件:進(jìn)樣量為1 μL,分流比10∶1,載氣為高純氦氣;柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2.0 min,以3 ℃/min程序升溫至230 ℃,保持3 min;MS條件:質(zhì)譜系統(tǒng)采用的是美國(guó)Aiglent公司的四極桿質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng),配有電子轟擊離子源和MassHunter工作站。采用電子轟擊離子源全掃描模式進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)量掃描范圍(m/z):30~600。

        1.3.11 核磁共振波譜分析多糖糖苷鍵的構(gòu)型

        稱取50 mg樣品溶解在D2O中。使用500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀,在25 ℃記錄核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)的1H-NMR譜圖和13C-NMR譜圖。

        1.3.12 DPPH自由基清除率的測(cè)定

        根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27]稍作修改,對(duì)COSP-4的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。將溶解于乙醇中的3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入至2 mL不同質(zhì)量濃度(1.0~5.0 mg/mL)的COSP-4溶液中,避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。無(wú)DPPH的反應(yīng)混合物作為對(duì)照,VC作為陽(yáng)性對(duì)照。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

        式中:A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度;A1為樣品與DPPH溶液的吸光度;A2為無(wú)DPPH的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

        1.3.13 羥自由基清除率的測(cè)定

        取0.2 mL不同質(zhì)量濃度的COSP-4(1.0~5.0 mg/mL)與1 mL 6 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液混合。混合溶液在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h,510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[28]。以無(wú)H2O2溶液的反應(yīng)混合物作為對(duì)照,VC作為陽(yáng)性對(duì)照。按式(2)計(jì)算羥自由基清除率。

        式中:A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液的吸光度,A1為樣品組混合溶液吸光度,A2為無(wú)H2O2溶液的反應(yīng)混合物溶液的吸光度。

        1.3.14 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

        根據(jù)文獻(xiàn)[29]稍作修改,測(cè)定COSP-4的2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽(yáng)離子自由基清除率。0.384 g ABTS和0.066 g過(guò)硫酸鉀溶解在100 mL蒸餾水中,室溫下避光反應(yīng)12 h,得到ABTS溶液。將10 mL ABTS溶液用pH 7.4 0.01 mol/L磷酸緩沖液稀釋50 倍,使734 nm波長(zhǎng)處吸光度約為0.7。將1 mL COSP-4溶液(1.0~5.0 mg/mL)與1 mL蒸餾水和2 mL ABTS工作液混合,充分混勻后室溫避光10 min,在734 nm處測(cè)定吸光度。未加入ABTS的反應(yīng)混合物作為對(duì)照,VC作為陽(yáng)性對(duì)照按公式(3)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

        式中:A0為無(wú)樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度;A1為樣品組吸光度;A2為無(wú)ABTS的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)為3 次重復(fù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.6軟件、MestReNova軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖的結(jié)果

        DEAE-52纖維素柱為陰離子交換層析柱,能根據(jù)樣品所帶電荷的強(qiáng)弱將其分成不同的組分。由圖1可知,經(jīng)過(guò)蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫,得到5 個(gè)多糖組分(COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5)。收集含量最高的多糖組分COSP-4,濃縮后透析,凍干得白色粉末,為山茱萸籽多糖初步分離純化組分COSP-4,回收率為20%左右。

        圖1 山茱萸籽多糖的DEAE-52柱層析洗脫圖Fig. 1 DEAE-52 anion-exchange column chromatography elution curve of Cornus officinalis seed polysaccharides

        2.2 葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果

        凝膠色譜柱是根據(jù)分子質(zhì)量大小對(duì)樣品進(jìn)行分離純化,分子質(zhì)量大的分子先流出色譜柱,分子質(zhì)量小的后流出,從而達(dá)到分離效果[30]。利用Sephadex G-100對(duì)經(jīng)過(guò)離子交換柱初步分離的山茱萸籽多糖COSP-4組分進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

        如圖2所示,用Sephadex G-100純化后的COSP-4為單峰,表明多糖樣品純度較高,為均一組分。主要餾分收集、濃縮、透析,凍干得精制的山茱萸籽多糖組分COSP-4呈白色粉末狀,回收率為70%。

        圖2 COSP-4組分的Sephadex G-100柱層析洗脫圖Fig. 2 Sephadex G-100 column chromatography elution curve of COSP-4

        2.3 多糖組分COSP-4的純度鑒定結(jié)果

        在紫外吸收光譜圖中,溶液在200 nm~300 nm范圍內(nèi)的吸收峰可以驗(yàn)證多糖中是否含大量的蛋白質(zhì)及核酸[31],從圖3可以看出,山茱萸籽粗多糖在280 nm處有明顯的吸收峰;而COSP-4在260 nm和280 nm處無(wú)明顯的吸收峰,初步表明純化多糖COSP-4幾乎不含蛋白質(zhì)與核酸,多糖純度較高。

        圖3 COSP-4組分的紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectra of the crude polysaccharide and COSP-4

        2.4 多糖分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

        分子質(zhì)量是多糖的重要結(jié)構(gòu)指標(biāo),影響多糖的理化和生物活性等性質(zhì)。采用HPGPC法測(cè)定COSP-4的平位均分子質(zhì)量。COSP-4的分子質(zhì)量約為2.03×104Da。峰位分子質(zhì)量(mp)為20 279 Da,重均分子質(zhì)量(mw)為17 359 Da,數(shù)均分子質(zhì)量(mn)為14 566 Da。多分散性指數(shù)(mw/mn)為1.191,接近1,說(shuō)明COSP-4的平均分子質(zhì)量分布較集中,結(jié)合葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果分析表明COSP-4純度較高。

        2.5 COSP-4紅外光譜分析結(jié)果

        如圖4所示,COSP-4的紅外光譜圖在3 442 cm-1附近出現(xiàn)了寬而強(qiáng)烈的吸收峰,表明氫鍵中存在羥基伸長(zhǎng)[32]。在2 927 cm-1附近的吸收峰是—CH3或—CH2—的弱C-H鍵的伸縮振動(dòng)所致[33]。1 637 cm-1和1 440 cm-1處的兩個(gè)峰分別是羧酸基的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起[34]。這證實(shí)了在COSP-4中存在糖醛酸,與單糖組成分析結(jié)果一致。同時(shí),在1 730 cm-1附近沒(méi)有明顯的吸收峰,說(shuō)明COSP-4中的葡萄糖醛酸沒(méi)有酯化[35]。1 382 cm-1處的弱吸收峰為烷基的C-H變角振動(dòng)吸收峰。在1 103 cm-1附近的弱吸收峰是吡喃環(huán)骨架的C-O變角振動(dòng)吸收峰,表明分子中存在C-O-H和C-O-C結(jié)構(gòu)[36]。在777 cm-1處存在弱吸收峰,推測(cè)含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu),其他結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

        圖4 COSP-4的傅里葉變換紅外吸收光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectrum of COSP-4

        2.6 單糖組成分析結(jié)果

        單糖組成分析在植物多糖的結(jié)構(gòu)與功效、中藥材的檢測(cè)與鑒定等方面有著十分重要的作用[37]。實(shí)驗(yàn)采用LC-MS分析COSP-4的單糖組成。

        如圖5所示,Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Fuc出峰時(shí)間依次為5.18、6.37、7.53、7.85、8.59、9.14、9.56、10.50 min,出峰分離度較好,無(wú)干擾現(xiàn)象,可作為多糖單糖組成進(jìn)一步分析的依據(jù)。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品與COSP-4保留時(shí)間確定單糖種類,根據(jù)各峰面積比計(jì)算單糖的物質(zhì)的量之比。COSP-4是一種由6 種單糖組成的酸性多糖。由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成,物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70,其中Xyl含量最高。

        圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)和COSP-4樣品(B)的單糖組成LC-MS圖Fig. 5 Liquid chromatograph-mass spectrometry chromatograms of mixed monosaccharide standard (A) and monosaccharide composition of COSP-4 (B)

        2.7 COSP-4的微觀結(jié)構(gòu)

        如圖6A所示,在5 000 倍下山茱萸籽多糖純化組分COSP-4主要是由不規(guī)則和支離破碎的結(jié)構(gòu)組成,并穿插帶有一些小的不規(guī)則顆粒,表面有碎片,為粗糙片狀。如圖6B所示,在30 000 倍下觀察到COSP-4疏松多孔,類似于海綿結(jié)構(gòu),多糖結(jié)構(gòu)表面粗糙,結(jié)構(gòu)松散。其結(jié)構(gòu)與山茱萸果肉多糖結(jié)構(gòu)[38]較為相似,均呈不規(guī)則形狀。

        圖6 COSP-4的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 SEM images of COSP-4

        2.8 COSP-4單糖殘基連接方式分析結(jié)果

        甲基化分析是測(cè)定多糖糖鏈中各種單糖殘基連接方式的重要手段之一。甲基化反應(yīng)是用甲基取代多糖上連接的羥基,然后完全酸水解取代后的產(chǎn)物,最后將水解產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析,獲得不同甲基化的單糖及其比例關(guān)系。如表1所示,在COSP-4中檢測(cè)到14 種甲基化糖,結(jié)果表明山茱萸籽多糖純化組分COSP-4中含量最高單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?;?2,3-二甲基木糖,物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為37.98%,其次為1,5-二乙?;?2,3,4-三甲基木糖,物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為18.30%。實(shí)驗(yàn)對(duì)山茱萸籽多糖純化組分COSP-4鏈狀結(jié)構(gòu)主要成分進(jìn)行了初步確定,為山茱萸籽多糖主鏈、側(cè)鏈的確定及三維空間結(jié)構(gòu)探索奠定一定的基礎(chǔ)。

        表1 COSP-4的甲基化反應(yīng)及GC-MS分析數(shù)據(jù)Table1 Methylation reaction and gas chromatography-mass spectrometry analysis of COSP-4

        2.9 COSP-4核磁共振波譜分析結(jié)果

        糖苷鍵的構(gòu)型和異頭碳在多糖結(jié)構(gòu)中的構(gòu)型可用一維核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)技術(shù)分析。1H-NMR主要用于解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō),不規(guī)則質(zhì)子殘留在δ5.00以上的質(zhì)子在α構(gòu)型中有化學(xué)置換,而低于δ5.00的質(zhì)子在β構(gòu)型中有化學(xué)置換。因此,這兩種糖可以通過(guò)δ值來(lái)區(qū)分。COSP-4的一維核磁(1H和13C)光譜如圖7所示。如圖7A所示,在COSP-4的1H-NMR譜中分別出現(xiàn)6 個(gè)1H信號(hào),分別為δ5.75、5.24、5.12、5.06、4.89、4.45,表明COSP-4中的殘基同時(shí)包含了α構(gòu)型糖基和β構(gòu)型糖基[39],同時(shí)表明,COSP-4中有6 種糖殘基,與單糖組成及甲基化反應(yīng)對(duì)應(yīng)的GC-MS分析結(jié)果一致。

        與1H-NMR相比,13C-NMR化學(xué)位移范圍寬廣,分辨率高,可以解析異頭碳的構(gòu)型,多糖殘基中取代位點(diǎn)和分支點(diǎn)。在13C-NMR波譜中,在區(qū)域內(nèi)的共振被指定為異頭碳原子。在鄰域δ101.69處有1 個(gè)異頭碳信號(hào),屬于1 個(gè)異頭碳?xì)埢腃1。一般來(lái)說(shuō),與α構(gòu)型連接的C1化學(xué)位移比β構(gòu)型低δ1.5~3.0,α構(gòu)型的化學(xué)位移是δ97~101,β構(gòu)型是δ103~105。從圖7B中可以看出,在COSP-4中主要存在有α構(gòu)型糖基。C2~C5信號(hào)的δ值均集中在δ70~77之間,說(shuō)明其中大部分尚未被取代。在δ60~70之間都有化學(xué)位移,說(shuō)明C6位置羥基一部分發(fā)生取代,一部分未發(fā)生取代。此外,δ16.57處的化學(xué)位移是由于鼠李糖的C6。

        圖7 COSP-4的1H-NMR譜圖(A)和13C-NMR譜圖(B)Fig. 7 1H-NMR spectrum (A) and 13C-NMR spectrum (B) of COSP-4

        2.10 COSP-4的抗氧化活性

        如圖8A所示,當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從0增加到3.0 mg/mL時(shí),COSP-4對(duì)DDPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從3.0 mg/mL提高到5.0 mg/mL時(shí),DDPH自由基的清除能力增長(zhǎng)較為緩慢。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí),COSP-4的DPPH自由基的清除率達(dá)到68.61%,5.0 mg/mL VC的DPPH自由基清除率高達(dá)99.60%。COSP-4和VC的半抑制質(zhì)量濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為(1.72±0.14)mg/mL和(0.49±0.04)mg/mL。

        圖8 COSP-4的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activity of COSP-4

        如圖8B所示,COSP-4對(duì)羥自由基具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加,COSP-4清除羥自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL后,羥自由基清除率增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩。COSP-4和VC的IC50分別為(1.48±0.17)mg/mL和(0.50±0.02)mg/mL。5.0 mg/mL VC的羥自由基清除能率可達(dá)99.8%,相同質(zhì)量濃度的COSP-4羥自由基清除率為72.24%。在之前的研究報(bào)道中,在質(zhì)量濃度為21.1 mg/mL的槐根多糖中羥自由基清除率74.02%[40],在0.3 mg/mL苦瓜多糖中,羥自由基清除率為63.92%[41]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山茱萸籽多糖COSP-4具有相對(duì)較好的清除羥自由基活性。

        如圖8C所示,在質(zhì)量濃度0~5.0 mg/mL范圍內(nèi),COSP-4對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。COSP-4和VC的IC50分別為(2.87±0.27)mg/mL和(0.50±0.06)mg/mL。在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí),COSP-4、VC的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率分別為61.68%、99.80%。

        3 結(jié) 論

        本研究成功地從山茱萸籽中分離純化了一種主要的多糖組分COSP-4,并對(duì)其結(jié)構(gòu)、抗氧化活性進(jìn)行了研究分析。結(jié)果表明,山茱萸籽多糖組分COSP-4是分子質(zhì)量約為2.03×104Da的酸性多糖,由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成,物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70。包含14 種甲基化糖,含量最高的單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?;?2,3-二甲基木糖,具有良好的羥自由基、DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力,有望在天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)等方面得到應(yīng)用,同時(shí)在醫(yī)藥和功能食品中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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