尤麗琴，姬 琛，羅瑞明

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是寧夏優(yōu)勢(shì)特色畜種，因其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富和風(fēng)味獨(dú)特而聞名。宰后肌肉成熟過程中主要發(fā)生的變化為細(xì)胞代謝和內(nèi)源性蛋白酶對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的降解[1]。宰后肉成熟過程中肌內(nèi)的生化反應(yīng)使肉中蛋白質(zhì)降解生成的氨基酸以及小分子肽類等風(fēng)味前體物質(zhì)在加熱時(shí)產(chǎn)生一系列風(fēng)味物質(zhì)。因此，宰后成熟不僅改善了肉的嫩度，還對(duì)肉的風(fēng)味產(chǎn)生影響，提高了肉的食用品質(zhì)。

肉的生產(chǎn)和加工過程會(huì)引起肌肉生物化學(xué)、蛋白質(zhì)豐度和結(jié)構(gòu)的變化[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究一定細(xì)胞、組織、體液、器官或有機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的科學(xué)[3]。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）是目前用于蛋白質(zhì)定量分析的有效技術(shù)，它具有較好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，允許同時(shí)對(duì)8 個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析，其與最高分辨率的多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度蛋白的定量定性分析。從生物學(xué)方面分析，轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾作用對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)具有調(diào)控作用，mRNA轉(zhuǎn)錄水平反映了其基因表達(dá)的中間狀態(tài)和相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況[4]。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)應(yīng)用范圍較廣，且能夠?qū)Σ煌锓N的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行有效的分析。宰后肉在成熟過程中包含復(fù)雜且相互依賴的生化機(jī)制，從而對(duì)肉的質(zhì)地、風(fēng)味和嫩度產(chǎn)生影響，為明確這一作用機(jī)制，可從蛋白質(zhì)組學(xué)角度出發(fā)研究肉的成熟過程[5]，從而探索成熟過程中肉品風(fēng)味特性變化規(guī)律。

目前宰后肉的蛋白質(zhì)組學(xué)分析多集中在宰后肉色澤、持水性能和嫩度的研究[6-12]，而宰后成熟肉中肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生風(fēng)味前體物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)完整性對(duì)風(fēng)味形成的影響機(jī)制還未明確。因此，本研究以灘羊背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，采用iTRAQ以及多維LC-MS/MS技術(shù)，研究宰后肉不同成熟期的差異表達(dá)蛋白，確定灘羊肉成熟前后蛋白質(zhì)的表達(dá)變化情況，同時(shí)采用qPCR技術(shù)對(duì)宰后灘羊肉中差異蛋白質(zhì)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析差異表達(dá)蛋白基因表達(dá)情況，并分析差異表達(dá)蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)之間存在的關(guān)系，初步探討宰后灘羊肉成熟過程中風(fēng)味前體物質(zhì)的變化機(jī)理及其調(diào)控，為進(jìn)一步研究灘羊肉宰后的代謝生化反應(yīng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長(zhǎng)肌 寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)食品有限公司。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國(guó)GE公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國(guó)Amresco公司；三乙二胺碳酸鹽和考馬斯亮藍(lán)G-250 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶美國(guó)Promega公司；乙腈和Nuclease-free H2O 美國(guó)Thermo公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）預(yù)混液、ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sciex Triple TOF 5600質(zhì)譜儀、Eksigent nanoLC-1D液相色譜系統(tǒng)（配有Analyst TF 1.1數(shù)據(jù)處理軟件） 美國(guó)SCIEX公司；5910R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Image Scanner III掃描儀 美國(guó)GE公司；真空冷凍干燥機(jī)、NanoDrop 2000分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；VCX130超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 美國(guó)Sonics公司；Mini PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；LightCycler?480 II型qPCR儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集成熟條件為溫度4 ℃、相對(duì)濕度80%的灘羊背最長(zhǎng)肌200 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時(shí)間點(diǎn)為0、4 d和8 d，每組樣本做3 個(gè)平行。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

結(jié)合李子欣等[13]的方法提取灘羊肉中總蛋白，采用BCA法定量蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.838 5x＋0.008 8，R2＝0.997 8），并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測(cè)蛋白質(zhì)量。其余樣品置于－80 ℃冰箱備用。灘羊肉中蛋白iTRAQ分析委托上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行，運(yùn)用Analyst TF 1.1軟件獲得基于iTRAQ分析的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)的定性及定量信息采用Protein pilot 4.0軟件獲得。檢索的數(shù)據(jù)庫為綿羊數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫來源為Uniprot。所有導(dǎo)出的蛋白質(zhì)可信度水平均高于95%（Unused score≥1.3且peptide≥1）。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，以“差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.2或FC＜0.8”和“P＜0.05”為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。

1.3.3 差異表達(dá)蛋白基因表達(dá)分析

1.3.3.1 RNA提取

灘羊肉中總RNA的提取采用mirVanaTMRNA Isolation Kit說明書進(jìn)行操作，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)確定RNA的純度，并使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以評(píng)估RNA完整性，將所得到的RNA置于－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 反轉(zhuǎn)錄

利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）將待測(cè)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 0.5 μg、4×gDNA wiper Mix 2 μL，加Nucleasefree H2O至8 μL，42 ℃保溫2 min去除基因組DNA，然后加5×HiScript II Q RT SuperMix II 2 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲(chǔ)存在－20 ℃冰箱備用。

1.3.3.3 qPCR分析

反應(yīng)體系參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書要求：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、cDNA 1 μL、Nuclease-free H2O 3.6 μL。采用LightCycler?480 II型qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每升高1 ℃采集5 次熒光信號(hào)。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行分析。引物基于美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得的mRNA序列設(shè)計(jì)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，如表1所示。以GAPDH為內(nèi)參，使用2－ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列Table1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)。使用Origin 2020 b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后灘羊肉蛋白提取與質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

宰后灘羊肉蛋白進(jìn)行提取后，采用SDS-PAGE對(duì)宰后不同成熟期灘羊肉蛋白樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。灘羊成熟0 d時(shí)的3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)（0 d-1、0 d-2和0 d-3）、成熟4 d時(shí)的3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)（4 d-1、4 d-2和4 d-3）和成熟8 d時(shí)的3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)（8 d-1、8 d-2和8 d-3）條帶均清晰度好，且完整均一，表明本次提取的蛋白質(zhì)量較好，可滿足后期iTRAQ技術(shù)分析要求。

圖1 宰后灘羊肉成熟過程中總蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of total proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

2.2 差異表達(dá)蛋白的篩選及豐度的變化

2.2.1 差異表達(dá)蛋白的篩選結(jié)果

通過iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS檢測(cè)宰后不同成熟期灘羊肉中差異蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，采用Protein pilot 4.0軟件檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選可信度水平在95%以上（Unused score≥1.3）且至少包含一個(gè)Unique肽段的蛋白為可信蛋白，多組重復(fù)以均能鑒定到可信蛋白為基本條件，共定性、定量鑒定出814 個(gè)可信蛋白。在鑒定出可信蛋白的基礎(chǔ)上，分別以“FC＞1.2或FC＜0.8”且“P＜0.05”作為宰后灘羊肉成熟時(shí)差異表達(dá)蛋白的篩選條件，共得到474 個(gè)差異表達(dá)蛋白。圖2為差異表達(dá)蛋白火山圖，能夠體現(xiàn)宰后灘羊肉不同成熟期差異表達(dá)蛋白的顯著性。由圖2A可知，宰后成熟0 d組和4 d組對(duì)比，差異表達(dá)蛋白159 個(gè)，其中4 d組與0 d組相比上調(diào)蛋白151 個(gè)，下調(diào)蛋白8 個(gè)；由圖2B可知，宰后成熟4 d組和8 d組對(duì)比，差異表達(dá)蛋白151 個(gè)，其中8 d組與4 d組相比上調(diào)蛋白35 個(gè)，下調(diào)蛋白116 個(gè)；由圖2C可知，宰后成熟0 d組和8 d組對(duì)比，差異表達(dá)蛋白164 個(gè)，其中8 d組與0 d組相比上調(diào)蛋白67 個(gè)，下調(diào)蛋白97 個(gè)。

圖2 宰后灘羊肉成熟過程中差異表達(dá)蛋白火山圖Fig. 2 Volcano plots of differentially expressed proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

由此可知，宰后成熟0～4 d時(shí)，灘羊肉中上調(diào)蛋白質(zhì)處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，數(shù)量較多，說明成熟4 d前宰后灘羊肉肌細(xì)胞尚未徹底凋亡，細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)尚在進(jìn)行，并且代謝活性大于蛋白質(zhì)降解程度。而宰后成熟4～8 d時(shí)，灘羊肉中下調(diào)蛋白數(shù)量較多，上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量減少，說明此階段蛋白質(zhì)降解程度明顯。宰后成熟0～8 d時(shí)，灘羊肉中差異表達(dá)蛋白的數(shù)量呈增加趨勢(shì)，說明成熟對(duì)灘羊肉蛋白質(zhì)變化的影響較大。

2.2.2 差異表達(dá)蛋白豐度的變化

基于宰后灘羊肉成熟過程中鑒定出差異表達(dá)蛋白的定量數(shù)據(jù)，根據(jù)“FC＞1.2或FC＜0.8”和“P＜0.05”的篩選標(biāo)準(zhǔn)，在成熟期0、4 d和8 d中兩兩對(duì)比的基礎(chǔ)上，共篩選出了262 個(gè)與風(fēng)味相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，其中0 d和4 d對(duì)比組有131 個(gè)差異表達(dá)蛋白，0 d和8 d對(duì)比組有133 個(gè)差異表達(dá)蛋白，4 d和8 d對(duì)比組有125 個(gè)差異表達(dá)蛋白。韋恩圖顯示了宰后灘羊肉成熟過程中差異表達(dá)蛋白的數(shù)量分布和差異，其中0 d和4 d對(duì)比組與4 d和8 d對(duì)比組共有的差異表達(dá)蛋白71 個(gè)，0 d和4 d對(duì)比組與0 d和8 d對(duì)比組共有的差異表達(dá)蛋白79 個(gè)，0 d和8 d對(duì)比組與4 d和8 d對(duì)比組共有的差異表達(dá)蛋白83 個(gè)，而0 d和4 d對(duì)比組、4 d和8 d對(duì)比組及0 d和8 d對(duì)比組3 組共有的差異表達(dá)蛋白46 個(gè)（圖3）。表2中列出了宰后成熟過程中灘羊肉中46 個(gè)共有差異表達(dá)蛋白的具體信息。

表2 宰后灘羊肉成熟過程中共有的差異表達(dá)蛋白Table2 Shared differentially expressed proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

續(xù)表2

宰后灘羊肉成熟過程中與風(fēng)味調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)蛋白主要集中在代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白等。宰后灘羊肉不同成熟期共有的差異表達(dá)蛋白中代謝酶和結(jié)構(gòu)蛋白的種類較多且含量變化較明顯，其中代謝酶15 種、結(jié)構(gòu)蛋白16 種、應(yīng)激蛋白3 種。肉風(fēng)味的變化主要取決于宰后肉中肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性和結(jié)構(gòu)蛋白降解程度的相互關(guān)系。本研究主要從宰后代謝酶調(diào)控、結(jié)構(gòu)蛋白降解和應(yīng)激蛋白的防護(hù)和抵御等方面來分析宰后灘羊肉成熟過程中影響風(fēng)味前體物質(zhì)形成的機(jī)制。

宰后肌肉代謝是影響肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[14]。糖酵解直接影響宰后肉能量代謝，進(jìn)而影響肉中風(fēng)味前體物質(zhì)的產(chǎn)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)參與糖酵解代謝的酶中，磷酸葡萄糖變位酶1、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛縮酶、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、烯醇酶3、L-乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在宰后灘羊肉成熟0～4 d時(shí)的表達(dá)上調(diào)，而在成熟4～8 d時(shí)絕大部分代謝酶表達(dá)下調(diào)。這是因?yàn)樾笄荼煌涝讜r(shí)，肌纖維處于低氧缺血狀態(tài)，使肌肉中腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）活性提高，宰后的肌肉能量代謝轉(zhuǎn)為無氧降解，在缺氧應(yīng)激的狀態(tài)下，活化的AMPK能夠激活提高糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性磷酸化酶激酶[16-18]，加強(qiáng)糖原分解。因此，宰后灘羊肉在成熟前期糖酵解途徑被調(diào)節(jié)，參與灘羊肉宰后成熟的糖酵解酶在成熟0～4 d時(shí)表達(dá)上調(diào)。隨著成熟的進(jìn)行，由于無氧降解產(chǎn)生乳酸及ATP分解產(chǎn)生磷酸根離子使pH值降低，參與糖酵解的這些酶受到抑制或失活，檢測(cè)到灘羊肉中糖酵解酶在成熟4～8 d表達(dá)下調(diào)。Ross等[19]研究宰后豬肉發(fā)現(xiàn)，前期豬肉磷酸化水平較高，導(dǎo)致pH值下降速率較快，而且經(jīng)磷酸化修飾的丙酮酸激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶與宰后肉pH值下降有關(guān)。趙巧靈[4]研究發(fā)現(xiàn)金槍魚冷藏過程中代謝酶中磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油激酶、丙酮酸激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶表達(dá)量變化明顯，且這些酶在糖酵解途徑中起調(diào)控作用。以上研究結(jié)果與本研究一致。綜上，宰后糖酵解酶的活性是影響宰后肉pH值下降速率的主要因素，其影響宰后肉僵直的進(jìn)程，并對(duì)肉中整體風(fēng)味的形成具有決定性作用。

宰后肉成熟過程中，由于肌原纖維和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的降解，肌肉結(jié)構(gòu)變得更松散，離子和蛋白質(zhì)之間的相互作用改變，內(nèi)部毛細(xì)管空間增加[20]。因此，宰后肌原纖維蛋白的水解及肌原纖維結(jié)構(gòu)的解離使肉的持水性、色澤和風(fēng)味等都可能受到影響。結(jié)構(gòu)蛋白與構(gòu)成細(xì)胞和生物體有關(guān)，是宰后肌肉收縮、能量代謝的基礎(chǔ)[21]。肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白等都與肌肉收縮有關(guān)，結(jié)構(gòu)蛋白直接影響宰后肉品質(zhì)，如嫩度、保水性和肉色等[22]。肌動(dòng)蛋白是參與肌肉收縮的蛋白，在肉制品加工過程中與肉品質(zhì)的黏結(jié)性和質(zhì)構(gòu)都有密切關(guān)系[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，宰后灘羊肉成熟0～4 d時(shí)，僅肌動(dòng)蛋白α1、肌動(dòng)蛋白（細(xì)胞質(zhì)1）和角蛋白1表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)。說明此階段肉中肌原纖維蛋白整體降解不明顯，肌原纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，一定程度上，肌原纖維的結(jié)構(gòu)完整性和降解程度反映了肌肉的成熟度，因此，宰后成熟4 d時(shí)灘羊肉的成熟過程尚未完成，風(fēng)味物質(zhì)還需進(jìn)一步降解產(chǎn)生。肌鈣蛋白由T、C、I 3 個(gè)亞基構(gòu)成，和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)鈣離子對(duì)橫紋肌動(dòng)蛋白ATP酶的活性從而調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)球蛋白相互作用[24]。灘羊肉中肌鈣蛋白C1、肌鈣蛋白C2和肌鈣蛋白T3在宰后成熟0～4 d時(shí)表達(dá)量上調(diào)，說明在此階段肌鈣蛋白活性較高，肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)球蛋白的相互作用被調(diào)節(jié)，使肌原纖維收縮增強(qiáng)，此時(shí)水分由于肌原纖維收縮被擠出，肌肉表面呈現(xiàn)多汁狀態(tài)，風(fēng)味物質(zhì)在此階段也會(huì)隨著汁液的浸出而流出。肌球蛋白輕鏈?zhǔn)羌?dòng)球蛋白復(fù)合物的組成部分，在肌肉的結(jié)構(gòu)保持和肌肉收縮過程中起重要的作用。宰后灘羊肉成熟0～4 d時(shí)，肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈6的表達(dá)量上調(diào)，說明肌原纖維蛋白在宰后成熟4 d時(shí)已逐漸發(fā)生降解，這是內(nèi)源酶的作用使肌動(dòng)球蛋白橫橋發(fā)生斷裂所致[25]。Marino等[21]研究了3 種不同品種牛肉成熟過程中肉質(zhì)形狀和肌漿蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)成熟過程中肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白T和原肌球蛋白的含量增加，說明肌纖維降解和蛋白水解隨成熟進(jìn)行逐漸加劇。宰后灘羊肉成熟4～8 d時(shí)肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和原肌球蛋白3表達(dá)量下調(diào)，說明此階段肌原纖維蛋白降解較明顯，結(jié)構(gòu)蛋白在保護(hù)細(xì)胞完整性中起到較重要的作用。宰后肌原纖維蛋白表達(dá)量的變化說明成熟對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)完整性和收縮能力的影響較大，肌原纖維蛋白水解可使蛋白質(zhì)降解為呈味氨基酸和肽類。綜上，肌原纖維蛋白不僅能降解產(chǎn)生風(fēng)味前體物質(zhì)，還能通過風(fēng)味前體物質(zhì)之間的相互作用影響風(fēng)味的感知，提升肉的風(fēng)味水平。

另外，蛋白質(zhì)如伴肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白T的降解會(huì)破壞肌原纖維的完整性，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生味覺氨基酸和肽類[26]。隨著成熟的進(jìn)行，宰后灘羊肉成熟4～8 d時(shí)肌鈣蛋白C1、肌鈣蛋白T3、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和原肌球蛋白3等蛋白表達(dá)量均下降，說明肌原纖維蛋白降解程度較明顯。Kemp等[27]發(fā)現(xiàn)宰后成熟肉中組織蛋白酶水解數(shù)量最多的肌原纖維蛋白主要包括肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、伴肌動(dòng)蛋白、肌聯(lián)蛋白和原肌球蛋白。宰后肌肉中的肌原纖維蛋白是肉中味覺活性成分的豐富來源，有研究發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白能夠提供8 133 種味覺氨基酸[28]。在肌原纖維蛋白中，味覺活性氨基酸和肽中含量較高的是肌鈣蛋白C（骨骼?。兄诟兄? 種基本味覺[26]。宰后灘羊肉成熟4～8 d時(shí)肌鈣蛋白C1和肌鈣蛋白T3的降解使肉中的味覺活性氨基酸和呈味肽含量增加，此階段灘羊肉中滋味屬性特點(diǎn)較明顯，味感豐富。此外，盧昊[3]的研究表明延邊牛宰后肌鈣蛋白降解程度與肉的嫩度有關(guān)。綜上，宰后灘羊肉成熟4～8 d時(shí)，肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，使呈味物質(zhì)較豐富，同時(shí)由于此階段肌原纖維結(jié)構(gòu)的完整性被破壞使風(fēng)味前體物質(zhì)更好地釋放。

應(yīng)激蛋白可防止肌細(xì)胞凋亡引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷和降解，并保護(hù)肌動(dòng)蛋白和其他細(xì)胞骨架蛋白免受應(yīng)激作用所引起的肽鏈斷裂[29]。熱休克蛋白70是ATP依賴性伴侶蛋白，它可以使部分變性蛋白聚集以及使蛋白折疊，從而保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激[30]。熱休克蛋白70可以直接參與代謝，本研究發(fā)現(xiàn)宰后灘羊肉成熟0～4 d時(shí)，應(yīng)激蛋白中熱休克蛋白70表達(dá)量上調(diào)，而成熟4～8 d時(shí)，熱休克蛋白70表達(dá)量下調(diào)。灘羊肉成熟過程中，熱休克蛋白70表達(dá)量的升高，說明成熟0～4 d時(shí)熱休克蛋白70可能參與保護(hù)肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性的作用，而成熟4～8 d時(shí)熱休克蛋白70表達(dá)量的下降說明此階段開始降解，這也體現(xiàn)出肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的降解變化動(dòng)態(tài)。另外，Bjarnado等[31]研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70的表達(dá)量與嫩度有直接關(guān)系。綜上，宰后灘羊肉成熟0～4 d時(shí)應(yīng)激蛋白的變化保護(hù)細(xì)胞骨架蛋白的完整性，使肌原纖原纖維結(jié)構(gòu)在此階段相對(duì)穩(wěn)定，這也與結(jié)構(gòu)蛋白的變化結(jié)果相吻合。

2.3 差異表達(dá)蛋白基因表達(dá)分析結(jié)果

2.3.1 差異表達(dá)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化

篩選與關(guān)鍵風(fēng)味代謝物調(diào)控作用相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，結(jié)合前期對(duì)灘羊肉風(fēng)味形成中重要蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)[13]，選取包含代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白在內(nèi)的共8 個(gè)差異表達(dá)蛋白，分別為糖原磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、L-乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌球蛋白輕鏈2、肌動(dòng)蛋白α1和熱休克蛋白70。采用qPCR對(duì)以上篩選出的差異表達(dá)蛋白在mRNA水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證，研究不同成熟期灘羊肉差異表達(dá)蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，分析各蛋白質(zhì)基因相對(duì)表達(dá)量及其變化規(guī)律。

采用qPCR檢測(cè)宰后灘羊肉成熟過程中8 種目標(biāo)差異表達(dá)蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的變化，如圖4所示，宰后成熟0～4 d時(shí)，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、L-乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌球蛋白輕鏈2和熱休克蛋白70在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上呈上調(diào)趨勢(shì)，而糖原磷酸化酶、丙酮酸激酶和肌動(dòng)蛋白α1在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上呈下調(diào)趨勢(shì)。而宰后成熟4～8 d時(shí)，糖原磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、肌動(dòng)蛋白α1和熱休克蛋白70在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上呈上調(diào)趨勢(shì)，而L-乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和肌球蛋白輕鏈2呈下調(diào)趨勢(shì)。對(duì)比整個(gè)成熟過程，各目標(biāo)差異表達(dá)蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平不同，L-乳酸脫氫酶在成熟0～4 d時(shí)上調(diào)較明顯，而丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和肌球蛋白輕鏈2在成熟8 d時(shí)下調(diào)較明顯，且?guī)缀踅咏?，這說明灘羊肉隨著成熟的進(jìn)行，差異表達(dá)蛋白的mRNA豐度在不同成熟階段不同。

圖4 目標(biāo)差異表達(dá)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的qPCR分析Fig. 4 qPCR analysis of the mRNA expression levels of target differentially expressed proteins

2.3.2 差異表達(dá)蛋白在蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

為了進(jìn)一步分析宰后成熟過程中灘羊肉中蛋白質(zhì)的變化機(jī)理，在不同成熟期分別對(duì)比與風(fēng)味相關(guān)差異表達(dá)蛋白的iTRAQ和qPCR結(jié)果，探討風(fēng)味相關(guān)差異表達(dá)蛋白在蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，結(jié)果如表3所示。

表3 風(fēng)味相關(guān)差異表達(dá)蛋白的iTRAQ和qPCR結(jié)果比較Table3 Comparison of results from iTRAQ and qPCR for flavorrelated differentially expressed proteins

差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾作用的調(diào)節(jié)下導(dǎo)致表達(dá)水平不同，從生物學(xué)角度分析，mRNA轉(zhuǎn)錄水平反映了基因表達(dá)的中間狀態(tài)，同時(shí)也反映了潛在的蛋白水平表達(dá)情況[32]。qPCR因檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。差異表達(dá)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的分析是針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的補(bǔ)充，在獲得基因表達(dá)情況的同時(shí)，也可以得知兩者之間的聯(lián)系，差異表達(dá)蛋白在蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究相互補(bǔ)充和驗(yàn)證，可為宰后灘羊肉中生物代謝變化和調(diào)控機(jī)制提供新的思路。

由表3可知，灘羊肉成熟過程中差異表達(dá)蛋白中有4 個(gè)差異表達(dá)蛋白在0～4 d和4～8 d時(shí)蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)模式一致，分別為2 個(gè)代謝酶（L-乳酸脫氫酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶）和2 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（肌球蛋白輕鏈2和肌動(dòng)蛋白α1），其余差異表達(dá)蛋白在兩種水平表達(dá)模式不一致，可能是由于宰后成熟過程灘羊肉中蛋白質(zhì)的降解不但來自自身內(nèi)源酶的作用，還可能受到外界酶的影響，從而改變了轉(zhuǎn)錄效率或轉(zhuǎn)錄后降解的速率[3]，在外界酶的調(diào)控下抑制或促進(jìn)了相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯，從而使兩種表達(dá)水平結(jié)果不一致。另外，本研究中差異表達(dá)蛋白如6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和熱休克蛋白70在4～8 d時(shí)mRNA轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，而在蛋白水平上呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，這可能是由于翻譯后修飾或在激活因子的作用下，這兩種蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)發(fā)生改變或失活，導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)而蛋白水平下降。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ技術(shù)對(duì)宰后灘羊肉不同成熟期的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，與風(fēng)味相關(guān)的差異表達(dá)蛋白主要分為代謝酶類、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白。灘羊肉不同成熟期差異表達(dá)蛋白存在不同程度的變化，灘羊肉中酶的活性在宰后成熟前期被激活且在風(fēng)味前體物質(zhì)變化中期發(fā)揮主要調(diào)控作用，結(jié)構(gòu)蛋白在宰后成熟后期降解較明顯，而應(yīng)激蛋白在成熟前期肌原纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起保護(hù)作用，隨著成熟的進(jìn)行逐漸降解或部分失活。采用qPCR對(duì)灘羊不同成熟期背最長(zhǎng)肌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)行了后續(xù)補(bǔ)充分析，使宰后成熟過程中灘羊肉中差異蛋白表達(dá)情況在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上得到了有效驗(yàn)證。