李曉斌，趙國(guó)棟，李 海，馬 晨，李鳳鳴，臧長(zhǎng)江，黃新新，李佳豪，許曉寶，馬玉輝，徐文慧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆昭蘇 835699)

0 引 言

【研究意義】L-瓜氨酸是機(jī)體氮素循環(huán)的重要參與者和中間代謝產(chǎn)物[1]，可從西瓜中分離獲取[2]。L-瓜氨酸可由成年動(dòng)物的腸道合成，主要用于腎臟合成精氨酸，以滿足機(jī)體對(duì)精氨酸的需求[3]。瓜氨酸合成精氨酸需要小腸特殊的酶參與完成，即這個(gè)反應(yīng)只能在小腸部位發(fā)生，因此，它在一些哺乳動(dòng)物精氨酸的內(nèi)源性合成中起重要作用[4]。L-瓜氨酸作為精氨酸的前體物質(zhì)，通過(guò)代謝被小腸吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)至腎臟合成精氨酸，進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體及血漿精氨酸的水平。【前人研究進(jìn)展】彭建平等[5]給雄性SD大鼠口服4.5 g/kg BW L-瓜氨酸，發(fā)現(xiàn)大鼠陰莖神經(jīng)海綿體內(nèi)壓、一氧化氮和一氧化氮合酶顯著提高，對(duì)于大鼠陰莖勃起具有增強(qiáng)作用。緱靈山等[6]研究不同劑量的L-瓜氨酸對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷保護(hù)作用，L-瓜氨酸能夠維持SOD的活力，降低MDA的生成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】精液中活性氧主要由白細(xì)胞和未成熟的精子產(chǎn)生，直接影響精液的品質(zhì)和抗氧化能力。當(dāng)前對(duì)于配種期種公馬精液品質(zhì)及抗氧化的研究主要集中在凍精及細(xì)管精液方面，而提高種公馬精液品質(zhì)和抗氧化能力的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以配種期種公馬為研究對(duì)象，研究補(bǔ)喂L-瓜氨酸，在精液品質(zhì)和抗氧化方面的作用，為種公馬繁殖性能的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬匹

試驗(yàn)選擇12匹年齡5～8歲的種公馬，平均采精量為(59.34±5.23)mL，平均體重為(532.34±49.14)kg。

1.1.2 精液

于試驗(yàn)0、10、20及30 d 每天08:00通過(guò)人工采精法采集公馬精液，測(cè)量采精量，將采集的精液平均分為2份，1份鮮精用于精液品質(zhì)檢測(cè)，另1份鮮精離心分離精子和精清，取精清于-20℃冷凍保存，待測(cè)。

1.1.3 血液

于試驗(yàn)0、10、20及30 d 早晨空腹頸部靜脈采集種公馬血液于肝素鈉抗凝管內(nèi)，3 500轉(zhuǎn)/min 離心15 min，取上清液，-20℃冷凍保存，待測(cè)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將12匹種公馬隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組6匹。在相同的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，飼喂相同營(yíng)養(yǎng)水平的日糧。在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)組馬匹每天補(bǔ)喂20 g L-瓜氨酸，將每天的L-瓜氨酸與精料補(bǔ)充料混合補(bǔ)喂。進(jìn)行為期30 d的飼喂試驗(yàn)，分別于試驗(yàn)開(kāi)始的前1 d(即為0 d)、10、20及30 d采集馬匹精液和血液，并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

所有試驗(yàn)馬匹在相同條件下飼養(yǎng)，粗飼料(苜蓿和混合牧草)和精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平一致，粗飼料自由采食，精料補(bǔ)充料4 kg/d ·匹，每匹馬投喂500 g/d胡蘿卜。所有馬匹進(jìn)行0.5 h/d的打圈運(yùn)動(dòng)。表1

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 精液品質(zhì)

分別測(cè)定采精量，使用OLYMPUS顯微鏡和Equine Motility軟件檢測(cè)鮮精精液品質(zhì)，包括活精子數(shù)(Motile,%)、精子密度(sperm density,108/mL)、直線運(yùn)動(dòng)率(progressive,%)、運(yùn)動(dòng)速度(VA,um/s)及快速運(yùn)動(dòng)比例(Rapid,%)。精子畸形率、精子質(zhì)膜完整性和精子頂體完整性參考王捷等[7]和徐文慧等[8]檢測(cè)的方法。

1.2.3.2 抗氧化指標(biāo)

血漿和精清中抗氧化指標(biāo)過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、抑制羥自由基能力(Inhibition to hydroxyl radical)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)均委托南京建成生物工程研究所采用試劑盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel整理，使用SAS8.0中Mixed混合模型統(tǒng)計(jì)，固定效應(yīng)有處理、采樣時(shí)間及二者之間的交互作用。方差結(jié)構(gòu)采用CS，數(shù)據(jù)為最小二乘平均值，顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)喂L-瓜氨酸對(duì)種公馬精液品質(zhì)的影響

研究表明，給種公馬補(bǔ)喂L-瓜氨酸能夠極顯著提高采精量、精子直線運(yùn)動(dòng)率及精子質(zhì)膜完整性(P<0.01)，與對(duì)照組相比較分別提高了28.08%、19.12%和36.18%；與對(duì)照組相比，活精子數(shù)、精子密度、運(yùn)動(dòng)速度和快速運(yùn)動(dòng)比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但比對(duì)照組分別提高了1.82%、6.99%、5.56%和14.54%；此外，試驗(yàn)組精子畸形率比對(duì)照組低了23.02%(P>0.05)，精子頂體完整性比對(duì)照組高了8.78%(P>0.05)。表2

表2 試驗(yàn)期30 d補(bǔ)喂L-瓜氨酸下種公馬精液品質(zhì)變化Table 2 Effects of supplemental L-citrulline on semen quality of stallion for 30 days

2.2 補(bǔ)喂L-瓜氨酸對(duì)種公馬精清抗氧化能力的影響

研究表明，補(bǔ)喂L-瓜氨酸可以極顯著提高公馬精液SOD的活力和抑制羥自由基的能力(P<0.01)，分別比對(duì)照組提高了29.10%和29.87%；顯著提高了種公馬精液GSH-PX的活力(P<0.05)，分別比對(duì)照組高28.15%；極顯著降低了精液MDA的濃度(P<0.01)，比對(duì)照組低43.43%；對(duì)于CAT活力無(wú)顯著性影響；NO濃度比對(duì)照組顯著提高了22.41%(P<0.05)。表3

表3 試驗(yàn)期30 d補(bǔ)喂L-瓜氨酸下種公馬精清抗氧化能力變化Table 3 Effects of supplemental L-citrulline on antioxidant capacity of seminal plasma of stallion for 30 days

2.3 補(bǔ)喂L-瓜氨酸對(duì)種公馬血漿抗氧化能力的影響

研究表明，補(bǔ)喂L-瓜氨酸可極顯著提高公馬血漿CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羥自由基的能力(P<0.01)，分別比對(duì)照組提高了50.48%、65.75%、26.32%和20.61%；極顯著降低了血漿MDA的濃度，降低了31.19%(P<0.01)；對(duì)于血漿SOD活力無(wú)顯著性影響。血漿NO的濃度比對(duì)照組顯著提高了14.44%(P<0.05)。表4

表4 試驗(yàn)期30 d補(bǔ)喂L-瓜氨酸下種公馬血漿抗氧化能力變化Table 4 Effects of supplemental L-citrulline on plasma antioxidant capacity of stallion for 30 days

3 討 論

提高種公馬的射精量和精液品質(zhì)，是滿足配種需求和品種改良的保障[9]。Bem等[10]研究指出，種公馬的性欲是影響其射精量和精液品質(zhì)的直接因素。研究顯示[11-12]，在種公畜日糧中添加VE、小肽均能夠顯著提高公畜的精液品質(zhì)及精子活力。任波等[13]研究結(jié)果顯示，在相同營(yíng)養(yǎng)水平日糧條件下添加賴氨酸∶蘇氨酸∶色氨酸∶精氨酸分別為100∶76∶40∶120能夠顯著提高種公豬精子頂體完整率、有效精子數(shù)目、總精子數(shù)目及精子活力。試驗(yàn)中，給種公馬補(bǔ)喂L-瓜氨酸能夠顯著提高采精量和精子直線運(yùn)動(dòng)率，L-瓜氨酸對(duì)公馬精子的生成和精子活力有顯著作用。這與趙國(guó)棟等[14]在小鼠上的研究結(jié)果一致，其研究顯示，給雄性小鼠補(bǔ)喂不同劑量的L-瓜氨酸與對(duì)照組相比均能顯著或者極顯著提高精子密度、直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和精子活力，極顯著降低畸形精子數(shù)。

試驗(yàn)中L-瓜氨酸能夠提高公馬采精量和直線運(yùn)動(dòng)率可能與L-瓜氨酸代謝合成精氨酸和NO有關(guān)[15-16]，但是在改善射精量和精液品質(zhì)中L-瓜氨酸通過(guò)何種路徑調(diào)控的，需進(jìn)一步深入研究。

研究顯示，活性氧是導(dǎo)致精子活力下降的直接因素之一[17]。精細(xì)胞內(nèi)氧化劑和抗氧化劑之間的平衡遭到破壞是精細(xì)胞損傷的主要原因，可引起DNA 堿基斷裂、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化以及遺傳物質(zhì)缺失[18]。前列腺和精囊腺是白細(xì)胞的主要產(chǎn)生組織，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與活性氧的產(chǎn)生有直接的關(guān)系，而精液中的活性氧主要來(lái)源于白細(xì)胞和未成熟的精子[19]。精液中含有少量的活性氧是機(jī)體正常的生理現(xiàn)象，正常水平的活性氧對(duì)精子活力有顯著促進(jìn)作用，特別是在激活精子獲能、頂體反應(yīng)以及受精的整個(gè)過(guò)程。當(dāng)活性氧大量存在時(shí)，超過(guò)了抗氧化系統(tǒng)的清除能力及精核獨(dú)特緊密結(jié)構(gòu)的防御能力時(shí)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生，精子自身對(duì)氧化應(yīng)激損傷修復(fù)能力缺乏，對(duì)精子造成不可修復(fù)的損傷[20]。

試驗(yàn)補(bǔ)喂L-瓜氨酸能夠極顯著提高精清SOD活力和抑制羥自由基的能力，顯著提高GSH-PX的活力，又顯著降低MDA的濃度，說(shuō)明L-瓜氨酸對(duì)精子抗氧化能力有顯著的提高作用，與補(bǔ)喂組精子直線運(yùn)動(dòng)率顯著高于對(duì)照組的結(jié)果一致。血漿結(jié)果顯示，補(bǔ)喂L-瓜氨酸能夠極顯著提高血漿CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羥自由基的能力，又顯著降低MDA的濃度，這與精子活力、精子直線運(yùn)動(dòng)率、精清抗氧能力顯著提高的結(jié)果一致，L-瓜氨酸能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，與緱靈山等[6]在大鼠上的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果顯示，血漿和精清中抗氧化酶活力和總抗氧化能力變化的趨勢(shì)一致，血漿中抗氧化酶及相關(guān)指標(biāo)升高時(shí)，反映于精清中的相關(guān)指標(biāo)呈升高趨勢(shì)。血漿游離物質(zhì)的水平在一定程度上能夠反映機(jī)體組織或者器官相應(yīng)物質(zhì)的水平和濃度。瓜氨酸在機(jī)體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為精氨酸 代謝，Elhattabd等[21]研究表明，給大鼠補(bǔ)喂L-精氨酸大鼠血清CAT活性，NO水平和T-AOC能力。研究顯示，瓜氨酸對(duì)膿毒癥早期大鼠肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，用瓜氨酸處理能夠顯著提高肝臟SOD活力，降低MDA水平[22]。L-瓜氨酸的補(bǔ)喂增加了機(jī)體精氨酸濃度，可能是提高精清和血漿抗氧化能力的路徑之一[23-24]。L-瓜氨酸具有清除自由基，提高抗氧化能力的作用[25-26]，但是清除自由基的路徑有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

給配種期種公馬補(bǔ)喂20 g/d的L-瓜氨酸采精量和精子直線運(yùn)動(dòng)率極顯著提高了28.08%和19.12%；精清SOD的活力和抑制羥自由基的能力極顯著提高了29.10%和29.87%；血漿CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羥自由基的能力極顯著提高了50.48%、65.75%、26.32%和20.61%。給種公馬補(bǔ)喂L-瓜氨酸能夠改善種公馬精液品，提高機(jī)體抗氧化能力。