陳星，周力量，劉東敬，艾碧君

白內(nèi)障是中低收入國家致盲的主要原因，全世界約有9 500 萬人患有白內(nèi)障；在我國，白內(nèi)障發(fā)病率有明顯升高的趨勢。目前，關(guān)于白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是其發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，而晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是后者發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)，故深入了解晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制對白內(nèi)障的防治意義重大。內(nèi)源性非編碼RNA 微小RNA（miRNA）普遍存在于真核生物體內(nèi)，可通過與靶基因3’非編碼區(qū)域（3’UTR）堿基互補(bǔ)配對的方式使靶基因降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控靶基因水平，參與白內(nèi)障等諸多人類疾病病理形成與發(fā)展進(jìn)程。資料顯示，一些miRNAs在眼部組織或細(xì)胞中特異性表達(dá)，它們通過對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。miR-595是miRNAs 家族成員，被證實(shí)在白血病、炎癥性腸病和骨髓增生異常綜合征等疾病中表達(dá)異常，并影響細(xì)胞凋亡過程。然而，miR-595 與白內(nèi)障發(fā)病關(guān)系并不清楚，故本研究通過觀察miR-595 在白內(nèi)障最常見類型——年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人晶狀體前囊膜組織表達(dá)及其對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響，以初步揭示白內(nèi)障發(fā)病與miR-595 關(guān)系，為臨床防治白內(nèi)障提供新線索。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集、試劑與儀器

收集2017年3月至2018 年12 月在成都普瑞眼科醫(yī)院診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障并行白內(nèi)障手術(shù)的48 例晶狀體前囊膜組織標(biāo)本（白內(nèi)障組），同時在成都普瑞眼科醫(yī)院眼庫中收集32 例無白內(nèi)障和青光眼等眼部疾病的正常供體眼球晶狀體前囊膜組織標(biāo)本（健康組），所收集到的標(biāo)本立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。本次?shí)驗(yàn)病人或其近親屬均已知情同意。人晶狀體上皮細(xì)胞永生系SRA01/04（上海研生實(shí)業(yè)有限公司），miR-595 mimics/inhibitor 及其陰性對照mimics/inhibitor-NC（廣州Ribobio 生物公司），胎牛血清、青鏈霉素混合液、DMEM 培養(yǎng)基和0.25% 胰蛋白酶（美國Gibco公司），psiCHECK2 熒光素酶報(bào)告載體（西安賽拓博泰生物），脂質(zhì)體2000 和Trizol 試劑（美國Invitrogen公司），兔抗人Bcl-2單克隆抗體（美國CST公司），兔抗人GAPDH 多克隆抗體（美國Abcam 公司），蛋白定量試劑盒（美國Pierce 公司），Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京KeyGEN Bio?TECH），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京Solarbio 科技公司），PCR 引物（上海生工生物公司）。ABI 7500Fast 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及HO處理

SRA01/04 細(xì)胞使用含100 U/mL 青鏈霉混合液和10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、于37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中生長。在6孔版中接種10個對數(shù)生長期的SRA01/04 細(xì)胞，至85% 匯合度時，將其分為HO組和對照組，每組3個復(fù)孔。其中，HO組細(xì)胞以含200 μmol/L HO的DMEM 培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基處理6 h，正常對照組細(xì)胞以原培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集對照組和HO組細(xì)胞，采用實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-595的表達(dá)水平。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-595 表達(dá)

采用Trizol 法提取白內(nèi)障組、健康組組織、HO組和對照組SRA01/04 細(xì)胞的總RNA，遵循反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作指示進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，制備逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。于PCR 儀上，將PCR 引物（miR-595 正向引物：5’-GGGTCGACCTCGAATCCTTA-3’，反向引物：5’-CGAGGCGGCCGACATGTTT-3’；內(nèi)參U6 正向引物：5’-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，）按照設(shè)定的擴(kuò)增程序（94 ℃5 min，94 ℃20 s、60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 cycles）進(jìn)行擴(kuò)增。 miR-595 的表達(dá)水平利用2法分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分為mimics-NC 組、miR-595 mimics 組、inhibitor-NC 組、miR-595 inhibi?tor 組，每組3 個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染時，在6 孔版中接種10個對數(shù)生長期的SRA01/04 細(xì)胞，培養(yǎng)至70% 匯合度。參照脂質(zhì)體2000 說明書步驟分別將120 nmol/L miR-595 mimics/inhibitor 及其陰性對照轉(zhuǎn)染至SRA01/04 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用“1.3”中實(shí)時熒光定量PCR 方法檢測四組SRA01/04 細(xì)胞中miR-595表達(dá)用于轉(zhuǎn)染效果評價。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將“1.4”中四組SRA01/04 細(xì)胞暴露于200 μmol/L HO1 h 后，遵循Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作指示，在流式細(xì)胞儀檢測SRA01/04細(xì)胞凋亡率。

1.6 免疫印跡法檢測Bcl-2 蛋白的表達(dá)

將“1.4”中四組SRA01/04 細(xì)胞暴露于200 μmol/L HO1 h，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，通過蛋白定量試劑盒定量。蛋白樣品熱變性后利用SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF 膜。封閉液（5% 脫脂奶粉）封閉PVDF 膜1 h 后，使用1∶1 000 比例稀釋的Bcl-2 和GAPDH（內(nèi)參）一抗工作液4 ℃下孵育過夜。封閉液洗膜后，再以1∶5 000 比例稀釋的二抗室溫孵育2 h。之后在暗室內(nèi)用化學(xué)發(fā)光劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析Bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-595 與Bcl-2 的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)TargetScan 軟件預(yù)測miR-595 與Bcl-2 3’UTR 的結(jié)合位點(diǎn)?？寺U(kuò) 增Bcl-2 基因的3’UTR區(qū)，并將其重組至psi?CHECK2熒光素酶載體上，作為Bcl-2野生型熒光素酶報(bào)告基因載體（Bcl-2-WT）；定點(diǎn)突變miR-595 與Bcl-2 基因的3’UTR 結(jié)合位點(diǎn)，克隆擴(kuò)增并重組至psiCHECK2載體，作為Bcl-2突變型熒光素酶報(bào)告基因載體（Bcl-2-MUT）。在6 孔版中接種10個將對數(shù)生長期的SRA01/04 細(xì)胞，培養(yǎng)至70% 左右匯合度時，參照脂質(zhì)體2000 說明書將miR-595 mimics/in?hibitor及其陰性對照mimics/inhibitor-NC分別與Bcl-2-WT、Bcl-2-MUT 共轉(zhuǎn)染至SRA01/04 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組SRA01/04細(xì)胞并利用熒光素酶活性檢測試劑盒測量熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-595 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織及SRA01/04 細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-595 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織及HO誘導(dǎo)構(gòu)建的SRA01/04 細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，miR-595 在白內(nèi)障組、健康組中的表達(dá)水平分別為（5.52±1.64）和（1.00±0.00），在HO組和對照組細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為（3.86±1.12）和（1.00±0.00）；與健康組相比，白內(nèi)障組中miR-595 表達(dá)水平明顯升高（

t

=8.26，

P

<0.05）；同時，HO組細(xì)胞中miR-595 表達(dá)水平明顯高于對照組（

t

=7.65，

P

<0.05）。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組SRA01/04 細(xì)胞中miR-595 表達(dá)

將miR-595 mimics 和miR-595 inhibitor 轉(zhuǎn) 染 至SRA01/04細(xì)胞48 h后，實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-595 的表達(dá)水平。結(jié)果表1 顯示，與mimics-NC 組比較，miR-595 mimics 組細(xì)胞中miR-595 表達(dá)水平明顯升高（

P

<0.05）；而miR-595 inhibitor組細(xì)胞中miR-595 表達(dá)水平較相應(yīng)對照inhibitor-NC 組明顯降低（

P

<0.05）。

表1 轉(zhuǎn)染后各組SRA01/04細(xì)胞中miR-595的表達(dá)水平和凋亡情況/x ± s

2.3 miR-595 對SRA01/04 細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞在HO中暴露1h 后，流式細(xì)胞儀檢測SRA01/04 細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果圖1 和表1 顯示，與mim?ics-NC 組比較，miR-595 mimics 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（

P

<0.05）；而miR-595 inhibitor 組細(xì)胞凋亡率較inhibitor-NC組明顯降低（

P

<0.05）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.4 miR-595 對SRA01/04 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

采用免疫印跡法進(jìn)一步檢測SRA01/04 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果圖2 和表2 顯示，miR-595 mimics 組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平較mimics-NC 組明顯降低（

P

<0.05），而miR-595 inhibi?tor 組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平較inhibitor-NC組明顯升高（

P

<0.05）。

圖2 免疫印跡法檢測miR-595對SRA01/04細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表2 各組SRA01/04細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

2.5 miR-595 和Bcl-2 靶向關(guān)系的驗(yàn)證

miR-595和Bcl-2 的結(jié)合位點(diǎn)采用TargetScan 軟件預(yù)測，見表3。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-595 和Bcl-2 是否存在靶向關(guān)系，結(jié)果表4 顯示，與mimics-NC 組相比，miR-595 mimics 可使轉(zhuǎn)染Bcl-2-WT 細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低（

P

<0.05）；同時，miR-595 inhibitor 與Bcl-2-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性較inhibitor-NC 組明顯升高（

P

<0.05）。然而，與相應(yīng)對照mimics-NC組 或inhibitor-NC 組 相 比，miR-595 mimics 和miR-595 inhibitor 對轉(zhuǎn)染Bcl-2-MUT 細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響（

P

>0.05）。

表3 miR-595與Bcl-2 3’UTR互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性的比較/x ± s

3 討論

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種發(fā)病率和致盲率很高的眼科疾病，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是其發(fā)生的早期特征，但其發(fā)生機(jī)制并不完全清楚。一些miRNAs 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜組織中異常表達(dá)，是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程的重要調(diào)節(jié)劑。例如：miR-15a-5p、miR-15a-3p 和miR-16-1-5p 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)均明顯升高，且可能通過調(diào)控抗凋亡基因Bcl-2 和Mcl-1 的表達(dá)，參與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程；在年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人晶狀體前囊中，miR-211 表達(dá)升高，對晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用；miR-125b 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人晶狀體前囊中呈現(xiàn)低表達(dá)，而miR-125b過表達(dá)可抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。

miR-595 是miRNAs 家族成員，定位于7q36.3 染色體上，被證實(shí)在多種組織中異常表達(dá)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等參與疾病的發(fā)生發(fā)展。如：miR-595在卵巢癌中表低達(dá)，上調(diào)miR-595起抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，并增強(qiáng)癌細(xì)胞對順鉑的敏感性；在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病病人中miR-595 表達(dá)與高甲氨蝶呤血漿濃度密切相關(guān)，而miR-595 治療可通過降低RFC1 蛋白表達(dá)和高甲氨蝶呤水平降低白血病CEM/C1 細(xì)胞凋亡率；另外，在高風(fēng)險的骨髓增生異常病人中miR-595 表達(dá)升高，RPL27A被證實(shí)是miR-595靶基因，敲除RPL27A可通過激活p53 抑制紅細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究在48 例年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人晶狀體前囊組織中檢測發(fā)現(xiàn)miR-595的表達(dá)水平明顯升高。該結(jié)果與李元彬在5例年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜組織中所得到的miR-595表達(dá)升高的結(jié)果相吻合。提示，miR-595 可能在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。強(qiáng)氧化劑HO在白內(nèi)障病人房水中的水平較正常人明顯升高，同時生理水平的HO可引起晶狀體渾濁；HO在晶狀體和房水的生理活動中發(fā)揮著重要作用。HO可體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，常被作為晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型的構(gòu)建。 本 研 究 參照文獻(xiàn)以200μmol/L 的HO誘導(dǎo)構(gòu)建晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-595 在HO誘導(dǎo)的凋亡模型中表達(dá)升高。這提示miR-595可能在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成功上調(diào)、下調(diào)miR-595 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-595 高表達(dá)可促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，而miR-595 低表達(dá)則抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，miR-595 在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。提示，miR-595 可通過促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的惡性進(jìn)展。

細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，與基因或蛋白的調(diào)控密切相關(guān)，如抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)缺失，與晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-595表達(dá)可使晶狀體上皮細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，而下調(diào)miR-595 表達(dá)則使Bcl-2 蛋白表達(dá)升高。采用TargetScan 軟件預(yù)測結(jié)合熒光素酶活性證實(shí)Bcl-2 是miR-595 的靶基因。結(jié)果表明，miR-595 可靶向調(diào)控Bcl-2 蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。這提示miR-595 可能通過靶向Bcl-2 表達(dá)促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-595 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中高表達(dá)，并可通過靶向調(diào)控Bcl-2促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，miR-595 有望成為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的治療靶點(diǎn)。