向從明，陳友干，孫承文，張笑，吳國勝

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，目前前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未闡明。miR?NA 是一種非編碼小分子RNA，其可介導(dǎo)參與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，從而影響腫瘤發(fā)生及發(fā)展。 微 小RNA-15a-5p（microRNA-15a-5p，miR-15a-5p）在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。通過生物信息學(xué)分析顯示蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（protein disulfide isom?erase A6，PDIA6）可 能 是miR-15a-5p 的 靶 基 因，PDIA6 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)展進(jìn)程。因此，本研究主要研究miR-15a-5p在前列腺癌組織中的表達(dá)及其對病人前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程的作用，及其可能相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)本來源：選取2018 年2 月至2019年3月江南大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科接受治療的前列腺癌病人50例，所有病人均經(jīng)病理學(xué)確診為前列腺癌，年齡（66.59±6.35）歲，將手術(shù)切除的前列腺癌組織、癌旁組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。前列腺癌DU145細(xì)胞由美國ATCC公司生產(chǎn)；Triolz和熒光定量檢測試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)；miR-15a-5p 寡核苷酸模擬物（miR-15a-5p mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miR-NC）、PDIA6 小分子干擾RNA（si-PDIA6）及其陰性對照（si-NC）、miR-15a-5p 特異性寡核苷酸抑制劑（antimiR-15a-5p）及陰性對照inhibitor NC 序列（antimiR-NC）由廣州銳博生物科技有限公司生產(chǎn)；Lipo?fectamine2000 由美國Invitrogen 公司生產(chǎn)；MTT、二甲基亞砜（DMSO）由美國Sigma 公司生產(chǎn)；兔抗人PDIA6抗體由武漢維克賽思科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

DU145 細(xì)胞接種于6 孔板（3×10個(gè)/孔），按照脂質(zhì)體法分別將miR-NC、miR-15a-5p mimics、si-NC、si-PDIA6、miR-15a-5p mimics 和pcD?NA、miR-15a-5p mimics 和pcDNA-PDIA6 轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，分別記作miR-NC組、miR-15a-5p組、si-NC組、si-PDIA6組、miR-15a-5p+pcDNA組、miR-15a-5p+pcDNA-PDIA6 組。轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含有胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 miR-15a-5p、PDIA6 mRNA 的檢測

將凍存前列腺癌組織和癌旁組織取出，各組DU145 細(xì)胞總的RNA 提取采用Trizol試劑。其過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，將反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用cDNA 為模板行熒光定量反應(yīng)，并計(jì)算miR-15a-5p、PDIA6 mRNA水平。

1.2.3 細(xì)胞增殖的檢測

將各組DU145 細(xì)胞接種于5×10個(gè)/孔的96 孔板，并每孔加入20 μL MTT 溶液，然后靜置培養(yǎng)4 h，棄其上清，每孔加入150 μL的DMSO，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀對吸光度值（OD 值）檢測測定。

1.2.4 細(xì)胞遷移與侵襲的檢測

將對數(shù)生長期的3×10個(gè)/毫升DU145 細(xì)胞分別每孔加入150 μL 上室，按照“1.2.1”分組處理，下室每孔加入完全600 μL 培養(yǎng)液，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用多聚甲醛將其固定20 min 后，用0.1% 結(jié)晶紫染液染色10 min，采用倒置顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞數(shù)。采用完全培養(yǎng)基稀釋的Matrigel 基質(zhì)膠，然后將Transwell小室上室每孔加入40 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h后，重復(fù)上述步驟。

1.2.5 miR-15a-5p 的靶基因的檢測

采用starBase在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示miR-15a-5p 與PDIA6 存在的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型載體和突變型載體（WTPDIA6、MUT-PDIA6），將miR-NC、miR-15a-5p mim?ics 分別與WT-PDIA6、MUT-PDIA6 共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.6 PDIA6、Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達(dá)的測定

取各組DU145 細(xì)胞，使用400 μL RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法對蛋白濃度進(jìn)行檢測，采用SDS-PAGE 凝膠電泳反應(yīng)將蛋白分離，然后蛋白迅速轉(zhuǎn)膜，并封閉1 h，分別加入PDIA6（1∶800）、Ki-67（1∶800）、PCNA（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）與內(nèi)參GAPDH 一抗稀釋液（1∶1 000）（美國Santa Cruz），4 ℃孵育24 h，TBST 洗滌，分別加入二抗稀釋液（1∶5 000）（美國Abcam），室溫孵育1 h，滴加ECL，顯影。應(yīng)用Quan?tityone軟件檢測條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-15a-5p 和PDIA6 在前列腺癌組織中的表達(dá)量比較

與癌旁組織比較，miR-15a-5p 在前列腺癌組織中的表達(dá)水平降低（

P

<0.05），而PDIA6 mRNA及蛋白水平升高（

P

<0.05），見圖1、表1。

圖1 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）在前列腺癌組織中的表達(dá)

表1 微小RNA-15a-5p（miR-15a-5p）與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）在前列腺癌組織中的表達(dá)量比較/± s

2.2 miR-15a-5p 過表達(dá)抑制前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

與miR-NC 組比較，miR-15a-5p組中細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)降低（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（

P

<0.05）。見圖2、表2。

表2 miR-15a-5p過表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響/（± s，n=9）

圖2 Western blotting法檢測Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的表達(dá)量

2.3 抑制PDIA6 對前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

與si-NC組比較，si-PDIA6組細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)降低（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（

P

<0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western blotting法檢測PDIA6、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的表達(dá)量

表3 抑制蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響/（± s，n=9）

2.4 miR-15a-5p 靶向調(diào)控PDIA6

PDIA6 的3’UTR 中含有與miR-15a-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4。miR-15a-5p 過表達(dá)可降低WT-PDIA6 的熒光素酶活性（

P

<0.05），見表4。miR-15a-5p過表達(dá)可降低PDIA6 蛋白水平，抑制miR-15a-5p 表達(dá)可提高PDIA6蛋白水平（

P

<0.05），見圖5、表5。

表5 miR-15a-5p靶向調(diào)控蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）的表達(dá)/（± s，n=9）

圖4 miR-15a-5p和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）互補(bǔ)的核苷酸序列

圖5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）法檢測蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）蛋白表達(dá)量

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/（± s，n=9）

2.5 PDIA6 過表達(dá)降低miR-15a-5p 過表達(dá)對前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

與miR-15a-5p+pcDNA 組比較，miR-15a-5p+pcDNAPDIA6 組細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)升高（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（

P

<0.05）。見圖6、表6。

圖6 Western blotting法檢測PDIA6、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量

表6 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6前體蛋白（PDIA6）過表達(dá)降低miR-15a-5p過表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用/（± s，n=9）

3 討論

我國前列腺癌發(fā)病率與死亡率逐年增加，已成為威脅男性健康的主要疾病，miRNA 可通過靶向調(diào)控下游mRNA 表達(dá)從而在前列腺癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。

miR-15a-5p 通過抑制WNT3A 表達(dá)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長。長鏈非編碼RNA HOXA 簇反義RNA2（LncRNA HOXA-AS2）通過調(diào)節(jié)miR-15a-5p / 同源基因A-3（HOXA3）分子軸而促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生及發(fā)展。還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-15a-5p 通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，miR-15a-5p在前列腺癌組織中表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-15a-5p 降低細(xì)胞存活率，提示過表達(dá)miR-15a-5p可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。研究表明細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67、PCNA 在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示miR-15a-5p 過表達(dá)后前列腺癌細(xì)胞中Ki-67、PCNA 的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步證實(shí)miR-15a-5p 過表達(dá)可減弱前列腺癌細(xì)胞增殖能力。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-15a-5p 可減少遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)，提示miR-15a-5p 過表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。

下調(diào)PDIA6 表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及侵襲。miR-376a 可通過抑制PDIA6 表達(dá)從而在骨巨細(xì)胞瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌作用。PDIA6 表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞侵襲。本研究結(jié)果顯示前列腺癌組織中PDIA6 的表達(dá)水平顯著升高，抑制PDIA6 表達(dá)可顯著降低前列腺癌細(xì)胞存活率及抑制細(xì)胞遷移、侵襲，miR-15a-5p可靶向結(jié)合PDIA6，PDIA6 過表達(dá)可減弱miR-15a-5p 過表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-15a-5p 過表達(dá)通過靶向PDIA6抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，可為前列腺癌的分子診斷及治療提供潛在靶點(diǎn)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制及其可能涉及的相關(guān)信號(hào)通路尚需進(jìn)一步探究。