李峰,王罡艷,陶薪吉
肺炎是臨床上常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病,其中肺炎鏈球菌是誘導(dǎo)肺炎發(fā)生的主要原因之一。肺炎鏈球菌能夠誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞凋亡和氧化損傷,從而破壞肺泡上皮完整結(jié)構(gòu),導(dǎo)致肺組織損傷發(fā)生。肺泡上皮細(xì)胞有兩種,分別為I 型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞有分泌表面活性物質(zhì)的作用,能夠維持肺組織正常功能的發(fā)揮,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷也是肺炎發(fā)生的重要原因。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)是SOCS家族成員,參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等過(guò)程。研究顯示,SOCS1 表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡,并且SOCS1 還參與外界因素刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷發(fā)生過(guò)程。本研究自2019 年2―7 月以Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的A549 細(xì)胞為對(duì)象,研究SOCS1 對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響,為明確肺炎發(fā)生機(jī)制以及SOCS1 在肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用提供參考。
1.1 材料
Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的A549 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;pcDNA3.1、pcD?NA3.1-SOCS1由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司構(gòu)建;肺炎鏈球菌R6 購(gòu)自美國(guó)ATCC;cDNA 合成試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(C-caspase-3)、SOCS1 抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(C-caspase-9)抗體、細(xì)胞色素C(Cytochrome C)抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組處理方法
A549 細(xì)胞分成正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組共四組,Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞分別為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-SOCS1 的A549 細(xì)胞,模型組、Vector+ 模型組、SOCS1+ 模型組細(xì)胞分別用1×10CFU/mL的肺炎鏈球菌刺激。正常組為正常不做處理的細(xì)胞。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行。1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)SOCS1 mRNA 表達(dá)
收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞,添加PBS 溶液洗滌,然后在細(xì)胞中加入Trizol 試劑,以常規(guī)方法分別提取RNA。將RNA 溶解在DEPC 水中。反轉(zhuǎn)錄條件為:37 ℃15 min,85 ℃5 s,4 ℃10 min,獲得的cDNA 在-80 ℃條件下保存,步驟同cD?NA 合成試劑盒。取cDNA,常規(guī)方法進(jìn)行SYBR Green qRT-PCR,PCR 條件為:95 ℃孵育15 s;60 ℃孵育60 s;一共40 個(gè)循環(huán)。把甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)設(shè)置為內(nèi)參,利用2方法計(jì)算SOCS1 mRNA 表達(dá)變化。引物由南京金斯瑞合成,序列如下:SOCS1 正向5,-ATGCAGTCTCCACAGCAG-3’,反向5’-CGAACGGAATGTGCGGAAGTG-3’;GAPDH正 向5,-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反 向5,-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)SOCS1蛋白表達(dá)
收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞,分別加入蛋白提取試劑,置于冰盒內(nèi)孵育裂解約30 min,將細(xì)胞裂解液收集,并以12 000 r/min 離心10 min。吸取上清溶液,利用BCA 方法測(cè)定各蛋白樣品濃度。SDSPAGE 電泳凝膠分別使用10% 的分離膠以及5% 的濃縮膠,按照30 μg 蛋白樣品上樣。在分離膠中電泳電壓設(shè)置為90 V,觀察染料快要進(jìn)入到分離膠時(shí),把電壓調(diào)整到120 V 繼續(xù)電泳。肉眼觀察染料進(jìn)入玻璃板的底部以后,停止電泳。取出凝膠,在冰上轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜1.5 h,電壓設(shè)置為60 V。取出PVDF膜,放在封閉液(5% 的牛血清白蛋白)中,放在室溫條件孵育2 h。將PVDF 膜放在SOCS1 抗體稀釋液中,4 ℃過(guò)夜。最后把PVDF 膜置于二抗反應(yīng)液中,于室溫環(huán)境孵育1.5 h。以ECL 方法顯色,用Bio-rad獲得圖像,內(nèi)參為GAPDH,分析目的蛋白水平。1.5 噻唑藍(lán)(MTT)測(cè)定細(xì)胞活性
按照正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組分組方法將細(xì)胞接種到96 孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后,添加20 μL MTT 溶液,繼續(xù)放在37 ℃孵育4 h。把孔內(nèi)液體吸棄,然后添加150 μLDMSO 溶液,孵育反應(yīng)10 min后,在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm 的OD 值,以空白孔調(diào)零以后,以正常組細(xì)胞存活率為100%,分析模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞存活率變化。1.6 LDH 和MDA、SOD 水平檢測(cè)
收集培養(yǎng)24 h以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞和培養(yǎng)液上清,分別利用LDH 含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)液上清中LDH 含量,以上清中LDH 含量占全部LDH 含量的百分比表示LDH 釋放率。同時(shí)利用MDA 含量檢測(cè)試劑盒和SOD 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量和SOD活性,步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞,將細(xì)胞收集并懸浮在500 μL 的結(jié)合緩沖液中,添加碘化丙啶(PI)染色液5 μL 混合,然后再添加Annexin V-FITC 染色液10 μL,充分混合后,放在避光條件下孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。1.8 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞C-caspase-3、Ccaspase-9 蛋白和線粒體、胞質(zhì)Cytochrome C 蛋白表達(dá)
收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vec?tor+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總蛋白和胞質(zhì)、線粒體蛋白,胞質(zhì)和線粒體蛋白提取步驟參照胞質(zhì)蛋白提取試劑盒和線粒體蛋白提取試劑盒,Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中C-caspase-3、C-caspase-9 水平和線粒體、胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平,步驟同“1.4”。線粒體蛋白內(nèi)參為porin,其余均為GAPDH。1.9 JC-1 法檢測(cè)線粒體膜電位
收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞,利用JC-1 法檢測(cè)線粒體膜電位,結(jié)果以紅綠熒光比值表示,操作步驟同線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒。2.1 pcDNA3.1-SOCS1 提高肺炎鏈球菌感染后A549 細(xì)胞中SOCS1 表達(dá)水平
肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞中SOCS1 mRNA和蛋白水平均下降,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549細(xì)胞中SOCS1 mRNA和蛋白水平(圖1、表1)。表1 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)蛋白水平/± s
圖1 Western blotting檢測(cè)pcDNA3.1-SOCS1對(duì)肺炎鏈球菌感染后A549細(xì)胞中SOCS1蛋白影響
2.2 上調(diào)SOCS1 對(duì)肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞活性和LDH 釋放影響
肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞存活率下降,LDH 釋放率增加,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞存活率并降低LDH釋放率見(jiàn)表2。表2 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶(LDH)釋放率/(%,± s)
2.3 上調(diào)SOCS1 對(duì)肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞SOD、MDA 水平影響
肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞SOD 活性下降,MDA 水平增加,轉(zhuǎn)染pcD?NA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞SOD 活性并降低MDA 水平。上調(diào)SOCS1 抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞氧化損傷。見(jiàn)表3。表3 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平/± s
2.4 上調(diào)SOCS1 對(duì)肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞凋亡影響
肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞凋亡率和Ccaspase-3、C-caspase-9蛋白水平增加,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1可以降低肺炎鏈球菌條件下A549細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平。上調(diào)SOCS1抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(圖2、表4)。表4 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平/± s
圖2 上調(diào)SOCS1對(duì)肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞凋亡和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平影響:A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡;B為Western blotting檢測(cè)C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平
2.5 上調(diào)SOCS1 對(duì)肺炎鏈球菌感染后的A549 細(xì)胞線粒體膜電位和胞漿、線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá)影響
肺炎鏈球菌感染后的A549 細(xì)胞線粒體膜電位下降,胞漿中Cytochrome C 蛋白水平升高,線粒體中Cytochrome C 蛋白水平降低,轉(zhuǎn)染pcD?NA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞線粒體膜電位,提高線粒體中Cytochrome C 蛋白水平,降低胞質(zhì)中Cytochrome C 蛋白水平(圖3、表5)。表5 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體、胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(Cytochrome C)蛋白水平/± s
圖3 Western blotting檢測(cè)pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平:A為線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá);B為胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白表達(dá)
肺炎鏈球菌是肺炎發(fā)生的誘導(dǎo)因子,其可以刺激肺泡上皮細(xì)胞損傷,誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)肺泡張力、維持肺泡功能的作用,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷與肺炎發(fā)展密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)顯示,肺炎鏈球菌刺激后的肺泡上皮細(xì)胞凋亡水平升高,細(xì)胞活性降低,并且細(xì)胞LDH 釋放率也增加,說(shuō)明成功構(gòu)建了肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷模型。
SOCS是由細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)負(fù)調(diào)控因子,其能夠抑制細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)的傳導(dǎo),SOCS1是SOCS家族中最早發(fā)現(xiàn)的蛋白成員,其參與免疫交叉反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程,SOCS1 是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)因子。研究顯示,SOCS1 與腫瘤、腎組織損傷、冠心病等疾病進(jìn)展有關(guān),調(diào)控SOCS1 表達(dá)可以影響疾病的發(fā)生。SOCS1 能夠減輕多種刺激因子誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,并且在不同的病理進(jìn)程中作用機(jī)制不同。近些年來(lái)的研究報(bào)道表明,SOCS1 在人肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá),并且與肺泡上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān),敲除SOCS1 誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)顯示,上調(diào)SOCS1 可以抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞活性,抑制細(xì)胞釋放LDH,提示上調(diào)SOCS1 具有抵抗肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷作用。
肺炎與氧化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān),氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷發(fā)生的機(jī)制之一。肺炎發(fā)生時(shí),肺泡上皮細(xì)胞中抗氧化酶活性降低可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過(guò)度積累,過(guò)量的氧自由基可以將細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化,產(chǎn)生大量的MDA。SOD 是存在于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶,其活性的高低與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)。另外,過(guò)量的氧自由基能夠刺激線粒體,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,使原本存在于線粒體中的Cytochrome C 進(jìn)入胞質(zhì),胞質(zhì)中的Cytochrome C 能夠激活Caspase-9。Caspase-9 是Caspase 蛋白家族成員,其位于Caspase 凋亡反應(yīng)的上游,其活化后可以誘導(dǎo)下游Caspase-3 的活化,而Caspase-3 活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)SOCS1 可以減少肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白表達(dá),減少細(xì)胞中MDA 含量,提高SOD活性,提高線粒體膜電位,提示上調(diào)SOCS1 可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。
總而言之,SOCS1 在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,其可以減輕細(xì)胞氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡。這為研究SOCS1 在肺炎中的作用和機(jī)制提供了參考,為探明肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷分子機(jī)制提供了資料。目前對(duì)于SOCS1 的具體機(jī)制仍不明確,在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)研究SOCS1在肺炎發(fā)生中的靶向調(diào)控機(jī)制。