楊喜科，姜平，付莉萍

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部癌癥之一，喉鱗狀細(xì)胞癌，簡(jiǎn)稱喉鱗癌，是喉癌的主要病理亞型。目前，喉鱗癌的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚。因此，探索喉鱗癌可能的分子機(jī)制，識(shí)別特定的生物標(biāo)志物，以提高病人診斷、治療和預(yù)后是十分必要的。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，最近的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了lncRNA 作為基因表達(dá)和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子 的 重 要 性。 反 義lncRNA CYP17A1-AS1（ENST00000369884）在喉鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)。反義lncRNA 可通過(guò)轉(zhuǎn)錄正調(diào)控或負(fù)調(diào)控其宿主基因表達(dá)。CYP17A1-AS1是細(xì)胞色素P450c17（cyto?chrome P450c17，CYP17A1） 的 反 義lncRNA，CYP17A1 在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與膠質(zhì)瘤和前列腺癌的進(jìn)展有關(guān)。關(guān)于CYP17A1-AS1 對(duì)喉鱗癌作用的報(bào)道尚不多見(jiàn)。wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin 在喉鱗癌組織中異位表達(dá)，lncRNA UCA1可以通過(guò)激活wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移?；诖?，本研究測(cè)定喉鱗癌組織和癌旁正常組織中CYP17A1-AS1 的表達(dá)水平，評(píng)估CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)對(duì)喉鱗癌細(xì)胞TU686 增殖、侵襲、遷移、凋亡和wnt/β -catenin 信號(hào)通路的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

喉鱗癌細(xì)胞TU686購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco，s modified eagle medi?um）、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，pcDNA-CYP17A1-AS1、pcDNA 購(gòu)自上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)相關(guān)試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司，Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/ propidium iodide，AnnexinⅤ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloprotease-2，MMP-2）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Associat?ed X Protein，Bax）、CYP17A1、β - 連環(huán)蛋白（β -catenin）、c-Myc、survivin 蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Sig?naling Technology 公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1.2 臨床樣本

39 例喉鱗癌組織和20 例癌旁正常組織（距離喉鱗癌邊緣≥2cm）來(lái)源于南陽(yáng)市中心醫(yī)院2016 年8 月至2018 年12 月未接受過(guò)治療的喉鱗癌病人。其中，Ⅰ、II 期喉鱗癌組織19 例，Ⅲ、Ⅳ期喉鱗癌組織20 例。標(biāo)本立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存。所有病人均簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)CYP17A1-AS1 表達(dá)

剪取喉鱗癌組織和癌旁正常組織50 mg，根據(jù)制造商的說(shuō)明，TRIzol 提取總RNA，轉(zhuǎn)換成cDNA，實(shí)施qRTPCR 反應(yīng)。CYP17A1-AS1 正向引物序列為5，- TC?CAGTCCCTTCCCAGTAGT-3，，反向引物序列為5，-CTCTGGCAGCCAAGCAGTAG-3，。以U6 為內(nèi)參，根據(jù)2方法分析CYP17A1-AS1的表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

TU686 細(xì)胞在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% 二氧化碳的條件下孵育。轉(zhuǎn)染前，TU686 細(xì)胞（5×10個(gè)/毫升）被接種于6 孔板中，細(xì)胞達(dá)約70% 匯合度時(shí)，在細(xì)胞中使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染pcDNACYP17A1-AS1 載體或其對(duì)照pcDNA，轉(zhuǎn)染48 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集轉(zhuǎn)染后的TU686 細(xì)胞，制成5×10個(gè)/毫升的密度，接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h后添加100 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，孵化4 h，200 μL 二甲基亞砜（Dimethyl sμlphoxide，DMSO）孵育10 min以溶解結(jié)晶，在490 nm 波長(zhǎng)下，酶標(biāo)儀讀取TU686細(xì)胞的吸光值（

A

值）。

1.6 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，TU686細(xì)胞在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中懸浮，然后接種到Transwell 腔室的上室。將含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑加入下室。24 h后，磷酸鹽緩沖液（phosphate Buffered Saline，PBS）沖洗3 次，用無(wú)菌棉簽去除未遷移的細(xì)胞。下膜表面遷移的細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，利用光學(xué)顯微鏡對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行成像和計(jì)數(shù)。

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中，用Matrigel 基質(zhì)膠包被Tran?swell上室，其余步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染后的TU686 細(xì)胞，在500 μL Binding Buffer 中重懸，黑暗中使用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色，15min后立即使用流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞百分比進(jìn)行量化。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)Cyclin D1、MMP-2、Bax、Bcl-2、CYP17A1、β -catenin、c-Myc、survivin 蛋白表達(dá)

采用蛋白提取試劑盒從細(xì)胞中提取總蛋白，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用BCA（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量的蛋白質(zhì)（50 μg）使用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-poly?acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離和轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。室溫下5% 脫脂乳封閉PVDF 膜2 h，與Cyclin D1、MMP-2、Bax、Bcl-2、CYP17A1、β-catenin、c-Myc、sur?vivin 和內(nèi)參β-actin（1∶1 000 稀釋）在4 ℃孵育過(guò)夜。Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液（tris buffered saline with Tween，TBST）沖洗后，用二抗（1∶5 000 稀釋）37 ℃孵育1.5 h。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并檢測(cè)PVDF膜的信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算目的蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CYP17A1-AS1 在各分期喉鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，癌旁組織、Ⅰ、Ⅱ期喉鱗癌組織、Ⅲ、Ⅳ期喉鱗癌組織CYP17A1-AS1 表達(dá)量分別為（1.00±0.09）、（0.67±0.07）、（0.31±0.06），與癌旁組織相比，不同時(shí)期喉鱗癌組織中CYP17A1-AS1 表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=429.595，

P

<0.05）。

2.2 CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)喉鱗癌細(xì)胞TU686增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

TU686 細(xì)胞，pcDNACYP17A1-AS1 組TU686 細(xì)胞中CYP17A1-AS1 表達(dá)量大幅升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05），說(shuō)明成功構(gòu)建CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)的TU686 細(xì)胞。MTT 法對(duì)細(xì)胞增殖的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，與pcDNA-control 組比較，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)顯著降低TU686 細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。Transwell 檢測(cè)結(jié)果表明，相比于pcDNA-control 組，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)明顯減少細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞遷移數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同pcDNA-control 組相比，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)明顯提高細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 CYP17A1-AS過(guò)表達(dá)對(duì)TU686細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響/± s

2.3 CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)對(duì)TU686 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot?ting 檢測(cè)Cyclin D1、MMP-2、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)，數(shù)據(jù)表明，與pcDNA-control 組比較，CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)明顯降低TU686 細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量，提高Bax 蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)TU686細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)TU686細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的影響/（± s，n=9)

2.4 CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)對(duì)TU686 細(xì)胞CYP17A1 的表達(dá)及wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響

相比于pcDNA-control組，CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)明顯減少CYP17A1、β-catenin、c-Myc和survivin蛋白表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。 見(jiàn)表3、圖2。

圖2 CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)TU686細(xì)胞CYP17A1的表達(dá)及wnt/βcatenin信號(hào)通路的影響

表3 CYP17A1-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)TU686細(xì)胞CYP17A1的表達(dá)及wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的影響/± s

3 討論

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占所有惡性腫瘤的1%～5%，也是中國(guó)第21 大最常見(jiàn)的癌癥，和第21 大癌癥相關(guān)死亡的主要原因。喉鱗癌作為常見(jiàn)的喉癌類型，仍然威脅著病人健康。目前，早期診斷并適當(dāng)治療仍是喉鱗癌病人生存的關(guān)鍵。通常lncRNA 在癌癥中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、癌癥分期進(jìn)展和病人生存密切相關(guān)。由于lncRNA 在組織和血清中易于檢測(cè)，被認(rèn)為是腫瘤有前途的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，并可用于開(kāi)發(fā)新的治療方法。lncRNA 作為生物標(biāo)記擁有許多優(yōu)點(diǎn)：它們?cè)隗w液（尿液，血液，唾液）中非常穩(wěn)定，并且與經(jīng)典活組織檢查相比，使用簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)（PCR，測(cè)序）可以非侵入性地檢測(cè)。此外，它們?cè)谏矬w液中差異表達(dá)，并且其表達(dá)具有組織特異性。在此基礎(chǔ)上，將不同的lncRNA與常規(guī)生物標(biāo)志物組合以獲得有效的診斷和/或預(yù)后具有一定意義。本研究中，與癌旁組織相比，CYP17A1-AS1 表達(dá)水平在喉鱗癌組織中明顯降低。提示CYP17A1-AS1的下調(diào)可能與喉鱗癌有關(guān)。

LncRNA 被認(rèn)為是基因調(diào)控的重要因子，通過(guò)不同的作用機(jī)制參與多種生理和病理方面，并與大多數(shù)類型的癌癥廣泛相關(guān)。在喉鱗癌中，lncRNA扮演著致癌基因或抑癌基因的角色影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。例如，SNHG20 可以促進(jìn)喉鱗癌的惡性進(jìn)展，敲除SNHG20 基因明顯抑制喉鱗癌細(xì)胞增殖。SOX2-OT 被鑒定為多種癌癥的致癌基因，SOX2-OT過(guò)表達(dá)促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。AC026166.2-001 在喉鱗癌中發(fā)揮抑癌作用，AC026166.2-001 過(guò)表達(dá)抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，降低細(xì)胞遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RP11-169D4.1 可作為喉鱗癌的抑癌基因和治療靶點(diǎn)，RP11-169D4.1 過(guò)表達(dá)抑制喉鱗癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而CYP17A1-AS1 對(duì)喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)明顯降低喉鱗癌細(xì)胞TU686增殖、侵襲、遷移、Cyclin D1、MMP-2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)，以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡、Bax蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗喉鱗癌的作用。

在過(guò)去的十年中，作為基因調(diào)控的參與者，ln?cRNA 與大多數(shù)癌癥類型廣泛相關(guān)。盡管lncRNA與癌癥有著明顯的聯(lián)系，但要從機(jī)制上理解它們是如何影響癌癥，仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。 研究表明，CYP17A1 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平明顯升高，沉默其表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。反義lncRNA 對(duì)其宿主基因表達(dá)具有一定調(diào)控作用，可正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)明顯減少CYP17A1 蛋白表達(dá)量，對(duì)CYP17A1 表達(dá)顯示出負(fù)向調(diào)控作用。Wnt /β-catenin 信號(hào)通路是參與各種人類疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵途徑，Wnt /β-catenin的激活在不同類型的癌癥中很常見(jiàn)。β-catenin、c-Myc 和survivin 蛋白是Wnt /β-catenin 信號(hào)通路的下游效應(yīng)器，參與癌癥發(fā)展。已有研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活是喉鱗癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力提升的原因，抗survivin、抗c-Myc抗體在喉鱗癌診斷和預(yù)后方面具有重要價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP17A1-AS1 過(guò)表達(dá)顯著抑制β -catenin、c-Myc 和survivin 蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明CYP17A1-AS1 對(duì)喉鱗癌的抗癌活性可能是通過(guò)抑制CYP17A1 表達(dá)并抑制wnt/β-catenin 信號(hào)通路活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，關(guān)于CYP17A1-AS1 調(diào)控wnt/βcatenin 信號(hào)通路分子通路的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，CYP17A1-AS1 在喉鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，可以抑制喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控CYP17A1 和wnt/βcatenin 信號(hào)通路有關(guān)，為喉鱗癌的治療提供了新思路。