孔凡鑫,王恒珍,周俊梅
尿毒清顆粒(無糖型)產(chǎn)品是由大黃、黃芪、桑白皮、苦參、白術(shù)、茯苓、白芍、制何首烏、丹參、車前草等藥味經(jīng)加工制成的中藥顆粒制劑,具有通腑降濁、健脾利濕、活血化瘀等功效,臨床主要用于慢性腎功能衰竭、氮質(zhì)血癥期和尿毒癥早期、中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁證和脾虛血瘀等病癥的治療,對降低肌酐、尿素氮,穩(wěn)定腎功能、延緩?fù)肝鰰r(shí)間,改善腎性貧血、提高血鈣、降低血磷等有一定的作用;藥味中白芍有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功能,車前草有淸熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒等功能,丹參有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功能;據(jù)統(tǒng)計(jì),2018 年我國尿毒癥病人約有70 多萬人,隨著人口老齡化趨勢的加劇,尿毒癥病人數(shù)量仍在持續(xù)上升階段,尿毒清顆粒(無糖型)臨床應(yīng)用越來越廣;尿毒清顆粒(無糖型)標(biāo)準(zhǔn)號:WS3-229(Z-033)-2000(Z),現(xiàn)收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第二十六冊,現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中,該產(chǎn)品的含量測定項(xiàng)針對白芍藥材,即芍藥苷成分含量進(jìn)行檢測,產(chǎn)品質(zhì)量無法得到較好的保障。本研究2020 年2―5 月建立HPLC波長切換法檢測尿毒清顆粒(無糖型)中成藥中芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ成分含量的分析方法。現(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 儀器
Perkin ElmerAltus A-10 型高效液相儀系統(tǒng),配備在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、PDA 檢測器(美國鉑金埃爾默公司);Waters Spheri?sorb ODS1 液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美國沃特世公司);賽多利斯QUINTIX2102-1CN 型電子分析天平(德國賽多利斯科技公司);KQ-5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司);Milli-Q Advantage A10 型超純水系統(tǒng)(美國默克密理博科技公司)。1.2 試藥
尿毒清顆粒(無糖型)3批次樣品為市售樣品,康臣藥業(yè)(內(nèi)蒙古)有限責(zé)任公司生產(chǎn),規(guī)格:每袋裝5 g,批次20191121、20191218 和20200116;芍藥苷對照品(編號110736-201943,含量以95.1%計(jì));大車前苷對照品(批次111914-201604,含量以90.2% 計(jì));丹參酮Ⅱ?qū)φ掌罚ň幪?10766-201721,含量以99.5% 計(jì))等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈:色譜純;磷酸:分析純;水為超純水;其他試劑均為分析純試劑。2.1 溶液的配制
2.1.1 混合對照品儲備溶液
分別精密稱取芍藥苷、大車前苷、丹參酮Ⅱ?qū)φ掌?,?0 mL 棕色容量瓶中,加90% 甲醇溶液超聲處理(功率250 W,頻率60 kHz)使溶解,加90%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,配制成每1 mL 溶液中含芍藥苷570.6 μg、大車前苷902 μg、丹參酮Ⅱ199 μg的混合對照品儲備溶液。2.1.2 混合對照品溶液
精密量取2.1.1 混合對照品儲備溶液2.5 mL,置25 mL 棕色容量瓶中,加90%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,即得。2.1.3 供試品溶液
取尿毒清顆粒(無糖型)適量,研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置50 mL棕色容量瓶中,加90% 甲醇溶液約40 mL,超聲處理30 min(功率250 W,頻率60 kHz)后取出,放冷,加90% 甲醇溶液至刻度,搖勻,0.45 μm 濾膜濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。2.1.4 陰性對照溶液
按尿毒清顆粒(無糖型)藥材配比和處方工藝,分別制備缺白芍、車前草和丹參的陰性樣品,陰性樣品按2.1.3 供試品溶液處理,制得陰性對照溶液。2.2 色譜條件
液相色譜柱:Waters Spherisorb ODS1液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:乙腈(A)- 0.2% 磷酸溶液(B),梯度洗脫,按表1洗脫程序進(jìn)行;流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:芍藥苷(230 nm)、大車前苷(330 nm)、丹參酮Ⅱ(270 nm)。表1 梯度洗脫程序/%
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 專屬性考察
取2.1.2 混合對照品溶液、2.1.3供試品溶液、2.1.4 陰性對照溶液,按2.2 色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下,3 個(gè)待測成分以及與其他雜質(zhì)之間均能基線分離,供試品溶液與對照品溶液中芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ色譜峰保留時(shí)間一致,陰性對照溶液對3 個(gè)待測成分的檢測無干擾。色譜圖見圖1。圖1 高效液相(HPLC)色譜圖:A為混合對照品溶液;B為供試品溶液;C為缺白芍陰性對照溶液;D為缺車前草陰性對照溶液;E為缺丹參陰性對照溶液;F為試劑空白溶液
2.3.2 精密度試驗(yàn)
取2.1.2 混合對照品溶液,按2.2 色譜條件,量取10 μL 注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ精密度RSD 分別為1.16%、0.78% 和0.89%,表明儀器精密度良好。2.3.3 線性關(guān)系考察
取2.1.1 混合對照品儲備溶液,分別精密移取適量,置50 mL 棕色容量瓶中,加90% 甲醇溶液定容,制備含芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ待測成分系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,按2.2 色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以各組分峰面積為縱坐標(biāo)(Y),相對應(yīng)對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。表2 芍藥苷、大車前苷和丹參酮ⅡA線性關(guān)系和范圍
2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批尿毒清顆粒(無糖型)(批次20191121)樣品,按2.1.3 供試品溶液制備方法,制備供試品溶液,同法平行制備6份,按2.2色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計(jì)算3種待測成分的含量。結(jié)果芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ重復(fù)性RSD 分別為3.16%、3.38% 和2.69%,表明此方法重復(fù)性良好。2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取尿毒清顆粒(無糖型)(批號次20191121)樣品,按2.1.3供試品溶液制備方法,制備供試品溶液,于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h,按2.2 色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ穩(wěn)定性RSD 分別為2.19%、1.46% 和2.02%,表明供試品溶液中3 個(gè)待測成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.6 加樣回收考察
取已測定含量的尿毒清顆粒(無糖型)(批次20191121)樣品,研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置50 mL 棕色容量瓶中,平行稱取6 份,分別精密加入2.1.1對照品混合儲備溶液適量,后續(xù)按2.1.3 處理,制得6 份加樣回收溶液,按2.2 色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。根據(jù)實(shí)際檢測量和加入量計(jì)算加樣回收結(jié)果。結(jié)果見表3。表3 加樣回收考察結(jié)果
2.4 樣品測定
取尿毒清顆粒(無糖型)3批次樣品[康臣藥業(yè)(內(nèi)蒙古)有限責(zé)任公司生產(chǎn),規(guī)格:每袋裝5 g,批次20191121、20191218 和20200116],按2.1.3 供試品溶液制備方法,制備供試品溶液,按2.2色譜條件,分別量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。計(jì)算3 份供試品中芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ的含量。結(jié)果見表4。表4 含量檢測結(jié)果/(毫克/片)
3.1 檢測方法的確定
常用于中成藥成分檢測的方法有:紫外分光光度法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等。尿毒清顆粒(無糖型)是由白芍、丹參、車前草等10 味藥材組成,成分較為復(fù)雜,采用紫外可見分光光度法,易受到其他基質(zhì)的干擾,造成檢測結(jié)果準(zhǔn)確度偏低;液相色譜-質(zhì)譜法專屬性好,定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確,但儀器價(jià)格昂貴,不利于方法的推廣使用;液相色譜法專屬性比紫外可見分光光度法好,且通過調(diào)節(jié)流動相的極性,可以將不同組分有效分離,定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確。因此實(shí)驗(yàn)選擇液相色譜法作為檢測方法。3.2 檢測波長的確定
尿毒清顆粒(無糖型)是由白芍、丹參、車前草等10味藥材組成,成分較多且各成分檢測波長差異較大。取2.1.2對照品混合溶液,按2.2 色譜條件,設(shè)定光譜采集范圍在200~400 nm之間,精密量取10 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜及光譜圖。根據(jù)譜圖可以看出:芍藥苷、大車前苷和丹參酮Ⅱ分別在230 nm 處、330 nm 處和270 nm 處有最大吸收,3 種待測成分最大吸收波長差異較大,無法采用單一波長進(jìn)行測定。故本研究最終采用波長切換法進(jìn)行3種待測成分含量的測定。3.3 流動相的確定
中成藥成分檢測場用的流動相體系有甲醇和乙腈體系。實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇-0.2% 磷酸水溶液、乙腈-0.2% 磷酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水4 種流動相組合體系。結(jié)果選擇甲醇體系時(shí),丹參酮Ⅱ洗脫時(shí)間較長,分析效率低下;選擇乙腈-水體系時(shí),3 種待測成分色譜峰保留時(shí)間不穩(wěn)定,選擇乙腈-0.2% 磷酸水溶液時(shí),3 種待測成分峰型最佳,且分析時(shí)間短。故實(shí)驗(yàn)確定流動相體系為乙腈-0.2%磷酸水溶液體系。3.4 提取方法的優(yōu)化
尿毒清顆粒(無糖型)藥味組成較多,基質(zhì)復(fù)雜,因此前處理方法的優(yōu)化,對于提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度有積極的作用。取尿毒清顆粒(無糖型)樣品,按2.1.3 供試品溶液處理,分別選擇甲醇、90% 甲醇溶液、80% 甲醇溶液和70%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí),考察對3 種待測成分提取情況的影響,結(jié)果選擇80% 甲醇溶液和70% 甲醇溶液時(shí),提取率偏低,選擇90% 甲醇溶液作為提取劑時(shí),提取效果最佳;再分別考察提取時(shí)間(20、25、30 和35 min)和超聲功率(200、250 和300 W)的影響,最終確定90% 甲醇溶液作為提取溶劑,超聲功率控制250 W,時(shí)間控制30 min為最佳條件。綜上,本研究建立HPLC 法檢測尿毒清顆粒(無糖型)中芍藥苷、大車前苷和丹參酮ⅡA 成分含量的分析方法,考察了建立方法的線性、重復(fù)性等參數(shù),實(shí)驗(yàn)證明方法重復(fù)性好、操作簡單,彌補(bǔ)了單一指標(biāo)成分含量測定作為質(zhì)控手段的不足。