趙紅喜，柳楊

機(jī)械性腦損傷是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，隨著工業(yè)、交通等領(lǐng)域的快速發(fā)展，機(jī)械性腦損傷發(fā)生率逐年增加。腦損傷的病理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷包括組織撕裂、細(xì)胞破碎及出血等，由原發(fā)性腦損傷引起的繼發(fā)性腦損傷包括水腫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞壞死凋亡等。目前腦損傷的治療均以減輕繼發(fā)性腦損傷為主，目前臨床大多使用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物或者激素類藥物以減輕炎癥反應(yīng)，但由于毒副作用大，不適于長期服用。

亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）是一種吩噻嗪類化合物，水溶性強(qiáng)，分子式為CHNS·Cl?3HO，相對分子質(zhì)量為373.90。亞甲藍(lán)進(jìn)入腦組織后，主要聚集于線粒體內(nèi)部，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡進(jìn)程等。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)對阿爾茨海默病、缺血性腦損傷及高原低氧所致腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有較好的治療作用。也有研究表明亞甲藍(lán)能夠通過促進(jìn)自噬改善創(chuàng)傷性腦損傷。但是對于腦損傷所引起的細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制研究較少。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Fctor-κB，NF-κB）是機(jī)體內(nèi)具有調(diào)節(jié)炎癥與免疫功能的細(xì)胞因子，能夠激活促炎因子、影響細(xì)胞增殖、遷移及凋亡過程，能夠促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-1β，IL-6 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)自2019 年3―8 月通過建立機(jī)械性腦損傷模型，探討MB對機(jī)械性腦損傷小鼠的治療作用與NFκB信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

亞甲藍(lán)、吡咯烷二硫代甲酸銨（pynolidine dithiocarbamate，PDTC）購自Sigma 公司，IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒購自默沙克生物公司，小鼠抗小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba-1）、β-actin、IκB-α 抗體、兔抗NF-κB p65、p-IκB-α 抗體購自Cell Signaling Technol?ogy（CST 公司），兔抗星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）抗體購自北京博奧森，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠、HRP 標(biāo)記驢抗兔二抗購自北京鼎國，凋亡試劑盒購自南京凱基，全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天生物。

1.2 儀器

石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）、紫外可見分光光度計(jì)（深圳邁瑞）、酶標(biāo)儀（深圳邁瑞）、倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF級C57BL/6雄性小鼠50只，體質(zhì)量范圍為20～25 g，購自遼寧長生生物有限公司［SCXK（遼）：2013-0001］，小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食水，室溫20～25 ℃，濕度50 %。本研究中對于小鼠的處理符合動物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為以下五組：假手術(shù)組（Sham 組）、機(jī)械性腦損傷組（SWI 組）、亞甲藍(lán)組（MB組）、NF-κB抑制劑組（PDTC組）、亞甲藍(lán)聯(lián)合NF-κB抑制劑組（MB+PDTC組），每組10只。

1.4 機(jī)械性腦損傷小鼠模型的制作

利用10 %水合氯醛麻醉小鼠后，利用腦立體定位儀將其固定，酒精消毒皮膚、被毛，旋轉(zhuǎn)定位儀旋鈕至損傷位點(diǎn)：顱骨中線左側(cè)2 mm、人字縫前2 mm。利用顱骨鉆鉆開一圓孔，將直徑為1.0 mm 針頭垂直插入腦組織中至2 mm 處，針頭停留5 min 后拔出，止血，縫合傷口，消毒。將小鼠重新放于鼠籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。Sham組只破壞顱骨，不進(jìn)行刺傷。手術(shù)1 h 后腹腔注射給予MB 1 mg/kg，每天一次；Sham 組給予等體積的蒸餾水；為了抑制NF-κB 信號通路活性，PDTC 組及MB+PDTC 組分別于造模前腹腔注射100 mg/kg PDTC溶液。

1.5 小鼠神經(jīng)功能評分評價

利用神經(jīng)功能缺損評分（neuological severity scores，NSS）對各組小鼠于模型制備成功3、7、14 及21 d 后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評價，NSS 評分總分為18 分，正常為0 分，隨著損傷嚴(yán)重程度增加，分?jǐn)?shù)逐漸升高。

1.6 TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡

于造模完成后7 d，將小鼠麻醉，心臟灌流后取腦，包埋，冰凍切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，厚度為7 μm，利用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediat?ed dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒法檢測小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組小鼠選取6 張切片標(biāo)本，顯微鏡下觀察凋亡情況，以Image J 軟件對照片中陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 蘇木精-伊紅（HE）染色

利用HE 染色檢測腦組織病理損傷，切片置于梯度乙醇溶液水化，蒸餾水沖洗1 min；蘇木精染液加熱染色2 min，流水洗去蘇木精液；l%鹽酸乙醇分化30 s，流水洗；1% 氨水反藍(lán)30 s，流水洗；伊紅染液染色2 min，流水洗；梯度乙醇溶液脫水：80 %乙醇1 min，95% 乙醇1 min，無水乙醇1 min；切片晾干，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-1β、IL-6及TNF-α水平

我們于損傷后3 d，利用ELISA檢測各組小鼠腦組織中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的水平變化。各組取損傷周圍腦組織100 mg，加入預(yù)冷的生理鹽水，制備成10% 腦組織勻漿液，電動勻漿器勻漿，8 000 r/min，離心20 min，取上清，隨后根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白

各組取損傷周圍腦組織100 mg，加入RIPA 裂解液，電動勻漿器勻漿，10 000 r/min，離心30 min，取上清；隨后利用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液，加熱10 min變性，之后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（100 V，90 min）、轉(zhuǎn)膜（250 mA，90 min）、加入相應(yīng)Iba-1（1∶1 000）、GFAP（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκB-α（1∶1 000）、p-IκB-α（1∶1 000）及β-actin（1∶1 000）一抗稀釋液孵育，4 ℃孵育過夜，次日室溫下孵育相應(yīng)二抗（1∶2 000），ELC 顯色液顯色后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并拍照，利用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

2 結(jié)果

2.1 MB 降低NSS 評分

分別于損傷后3、7、14 及21 d后對小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評價，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham 組相比，SWI 組小鼠NSS 評分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）；而給予MB 治療后能夠明顯降低NSS評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05），說明MB 能夠促進(jìn)SWI 小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)；給予PDTC 之后，PDTC、MB+PDTC 組與SWI 組相比NSS 評分降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05），且PDTC 與MB+PDTC 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05），說明PDTC 抑制了MB 改善SWI 小鼠神經(jīng)功能的作用（表1）。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分比較/(分，± s）

2.2 MB 抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡

于損傷后7 d 利用TUNEL 試劑盒檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，觀察MB 對SWI 后大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果見圖1和表2，SWI組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，與Sham組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖中藍(lán)色為細(xì)胞核DAPI，紅色為凋亡細(xì)胞，

P

<0.01），MB 組與SWI 組相比，能夠顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)量（

P

<0.05），說明MB 能夠減少腦損傷小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。PDTC 及MB+PDTC組與SWI 組相比，T 凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且MB組與PDTC 及MB+PDTC 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05），提示PDTC可抑制MB的抗凋亡作用。

表2 各組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較

2.3 MB 減輕腦組織病理損傷

利用HE 染色檢測各組小鼠大腦皮層病理損傷情況，結(jié)果見圖2，Sham組皮層神經(jīng)元清晰致密、染色形態(tài)正常、排列均勻、胞體飽滿、胞核呈藍(lán)色；而SWI 組傷口周圍可見大量的紅細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤明顯，神經(jīng)元皺縮、胞質(zhì)深染、核不清晰、壞死明顯；而MB、PDTC 及MB+PDTC 組傷口周圍神經(jīng)元形態(tài)明顯改善、炎癥細(xì)胞浸潤減輕、壞死細(xì)胞數(shù)量減少，紅細(xì)胞溢出情況減輕，且三組之間無明顯差別。

2.4 MB 減輕SWI所致炎癥反應(yīng)

為了探究MB對SWI 引起的炎癥反應(yīng)的影響，我們檢測了小鼠腦組織中炎性因子IL-1β、IL-6 及TNF-α 的表達(dá)水平；并檢測了腦組織中Iba-1、GFAP 蛋白表達(dá)情況。ELI?SA 結(jié)果顯示，SWI 組小鼠損傷皮層IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平明顯升高，與Sham 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.01）；MB 組、PDTC 組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平明顯降低，與SWI 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05，

P

<0.01），而MB 組與PDTC 組、MB+PDTC 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P>

0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中白細(xì)胞介素（IL）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平比較/(ng/mL，± s）

Western blotting 結(jié)果顯示，小鼠腦損傷后Iba-1、GFAP 蛋白表達(dá)明顯增加，與Sham 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.01），MB 能夠明顯減少腦內(nèi)Iba-1、GFAP蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.01）；PDTC及MB+PDTC 組與SWI 組相比，Iba-1、GFAP 蛋白表達(dá)明顯減少，且MB、PDTC 及MB+PDTC 組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05），提示PDTC 可減弱MB對炎癥反應(yīng)的抑制作用。見圖3與表4。

圖3 各組小鼠腦組織中Iba-1及GFAP蛋白表達(dá)（Western blotting檢測圖）

表4 各組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba-1）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）蛋白水平比較/± s

2.5 亞甲藍(lán)抑制NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

為了研究MB 治療對SWI 小鼠腦組織NF-κB 信號通路活性的影響，我們檢測了NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與Sham 組相比，SWI 組NFκB p-65、p-IκB-α 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（

P

<0.05），而IκB-α 蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）；MB 組小鼠腦組織中NF-κB p-65、p-IκB-α 蛋白表達(dá)明顯降低，而IκB-α 蛋白水平明顯升高，與SWI 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）；而MB 組與PDTC 組、MB+PDTC 組相比，NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P>

0.05，圖4 與表5），提示給予PDTC 后MB 抑制NFκB 信號通路活性的作用被阻斷，說明MB 對SWI 小鼠的治療作用可能與抑制了NF- κB 信號通路有關(guān)。

表5 各組小鼠腦組織中NF-κB p-65、IκB-α及p-IκB-α蛋白水平比較/± s

圖4 各組小鼠腦組織中NF-κB p-65、IκB-α及p-IκB-α蛋白表達(dá)（Western blotting檢測圖）

3 討論

繼發(fā)性腦損傷在損傷后數(shù)小時內(nèi)發(fā)生，繼發(fā)損傷的基本機(jī)制主要包括氧自由基、神經(jīng)炎癥、腦水腫和神經(jīng)元凋亡。腦損傷誘發(fā)的神經(jīng)炎癥主要以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為主要特征，損傷發(fā)生后腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并遷移至損傷周圍，并且能分泌大量的炎性因子，比如，IL-6，IL-1β 和TNF-α，破壞血腦屏障，從而加劇了腦水腫、炎癥級聯(lián)反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡。因此，如何抑制腦損傷后炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)患者受損神經(jīng)功能一直是本研究領(lǐng)域的關(guān)鍵。

MB 是在臨床上廣泛使用并且在治療劑量范圍內(nèi)無明顯不良反應(yīng)的藥物。MB 從被發(fā)現(xiàn)后，曾先后用于治療高鐵血紅蛋白血癥、瘧疾、氰化物中毒、膿毒血癥及外科手術(shù)的示蹤劑等。有研究表明，MB 的LD腹腔注射給藥為150 mg/kg，而靜脈給藥LD為77 mg/kg。而且一般認(rèn)為，靜脈給藥劑量在10 mg/kg 以下都是安全的，并且其起治療作用的劑量通常也是低劑量，一般在4 mg/kg 以內(nèi)。近年來研究表明MB 在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有明顯的藥理作用。MB 能夠顯著降低APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦實(shí)質(zhì)和腦血管β-淀粉樣蛋白沉積物以及各種Aβ 物種（包括寡聚物）的水平，從而改善其認(rèn)知功能障礙。MB 能夠通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子來保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，減輕MPTP 對神經(jīng)元誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。在腦損傷小鼠模型中，在損傷1 d 后，MB 顯著改善腦組織水腫并降低了炎性基因在巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞中表達(dá)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MB 腹腔注射1 mg/kg 的劑量能夠明顯改善小鼠神經(jīng)功能缺損評分，阻止SWI導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡并能改善病理損傷。

腦損傷后會引發(fā)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨癐L-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子的過度釋放。IL-1β 和TNF-α 是SWI 中最早被釋放的炎性因子，兩者還能夠發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)其他炎性因子的生成與釋放；IL-6 也是炎癥反應(yīng)過程中一個重要的炎性因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MB 能顯著抑制SWI 小鼠模型腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并降低損傷腦組織周圍IL-1β、IL-6和TNF-α 因子的表達(dá)，提示MB能夠通過抑制炎性因子的生成與釋放及膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕SWI引起的炎癥反應(yīng)。

NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡、分化及炎癥等方面具有重要作用，NF-κB 通路的激活可誘導(dǎo)IL-6，IL-1β和TNF-α等炎性因子的表達(dá)，且IL-6，IL-1β 和TNF-α 等炎性因子釋放增加也會激活NF-κB信號通路，形成反饋環(huán)路，從而誘發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。抑制NF-κB 信號通路使IκB-α 的磷酸化被抑制，并能阻止因NF-κB 從IκB-α 中釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后所引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。并且NFκB 信號通路的活化能夠參與皮層及海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，腦損傷后NF-κB 在神經(jīng)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡基因及蛋白，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。的本研究發(fā)現(xiàn)，MB 能夠顯著降低腦損傷小鼠NF-κB p-65、p-IκB-α蛋白表達(dá)，而升高IκB-α蛋白水平，說明MB對腦損傷小鼠NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白具有調(diào)控作用。

為了探討MB 對腦損傷小鼠模型的治療作用與調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)，在制備SWI小鼠模型前，利用100 mg/kg 的PDTC 封閉NF-κB 信號通路，抑制其活性。結(jié)果顯示，NF-κB 信號通路被封閉后，MB 對小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響、對炎癥反應(yīng)的影響及對NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白的調(diào)控作用被抑制，進(jìn)一步說明MB 減輕繼發(fā)性腦損傷的作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB 信號通路活性實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究表明，MB 能改善腦損傷后小鼠的神經(jīng)功能、抑制細(xì)胞凋亡、減輕損傷后的炎癥反應(yīng)，這可能在一定程度上與抑制了NF-κB 信號通路活性有關(guān)，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。雖然目前MB 距離成為腦損傷的臨床治療藥物還有很遠(yuǎn)的路要走，但相信在今后有一天通過劑型優(yōu)化、結(jié)構(gòu)修飾等手段能夠降低甚至消除亞甲藍(lán)的毒副作用，其能夠成為安全有效的腦損傷臨床治療藥物。