王欣玉，裴曉東，何志龍，林佳雯，黎永卓，陳文卿，劉小玲，蔣利和，3

惡性腫瘤是當今極難治愈的疾病之一，嚴重地威脅著人類的生命健康，是致死率第二高的疾病。其中肝癌作為第二大致死癌癥，僅次于肺癌。目前，我國已成了全球肝癌發(fā)病率和死亡率最多的國家，每年肝癌發(fā)病約34.7 萬人，占到全球的55%，死亡32.3 萬人，占全球的45%，晚期肝癌病人只有大約15% 的人適合手術(shù)切除，多數(shù)病人選擇放化療治療的方法。目前，化療藥物因其高毒性和耐藥性使病人預(yù)后較差，祖國傳統(tǒng)中藥材具有多靶點低毒性的優(yōu)點，因此人們期待在傳統(tǒng)中草藥中有應(yīng)用前景的天然產(chǎn)物。

香茶菜屬（

Isodon

）植物隸屬唇形（Lamiaceae）科羅勒亞科（Ocimoideae），約有30 余種在我國和日本民間被廣泛使用，它們大多具有清熱解毒、抗炎抗菌及抗腫瘤等作用。其中尾葉香茶菜產(chǎn)于黑龍江、吉林及遼寧等地區(qū)，活性成分包括二萜類化合物尾葉香茶菜丙素（Kamebakaurin），尾葉香茶菜丙素對慢性骨髓性白血?。–ML）有治療活性，且對心、肝、脾、肺、腎5 個臟器無副作用，還可減少撲熱息痛引起的肝損傷；在抑制腫瘤方面，可通過抑制HIF-1α 蛋白表達抑制結(jié)腸癌細胞HCT116 和SNu638 生長。但是在對耐藥腫瘤方面還未見文獻報道，因此本研究自2018 年11 月至2019 年11 月通過尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM 細胞的生長活力、遷移能力、細胞凋亡和周期的影響和可能機制，初步探明尾葉香茶菜丙素對耐藥肝癌的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尾葉香茶菜丙素購買于成都艾法公司，純度99%；阿霉素購自上海生工，純度99%。尾葉香茶菜丙素先用DMSO 溶解成200 μmol/L 濃度的母液，使用時用DMEM 稀釋。胎牛血清購自美國GIBCO 公司，HepG2/ADM 細胞購自上海中科院細胞庫，周期試劑盒購于聯(lián)科公司，CCK-8 購于MCE 公司，凋亡試劑盒購于BD 生物公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒和蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑均購自索萊寶公司，PCR 引物由上海生工合成。抗體β-Tublin 多克隆抗體（貨號10068-1-AP），p-AKT 多克隆抗體（貨號66444-1-Ig），MDR1 多克隆抗體（貨號22336-1-AP），Bax 多克隆抗體（貨號50599-2-Ig），Bcl-2 多克隆抗體（貨號12789-1-AP），AKT 多克隆抗體（貨號10176-2-AP）GAPDH 多克隆抗體（貨號60004-1-Ig），PTEN 多克隆抗體（貨號22034-1-AP）均在Proteintech 購買；p-PTEN 單克隆抗體（貨號AP0930）購自AbClon生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DMI4000B 倒置熒光顯微鏡購于日本奧林巴斯公司；CO恒溫培養(yǎng)箱購自Eppendorf AG；低溫離心機購于廣州吉迪儀器有限公司；BGPower 300電泳儀產(chǎn)自貝基恩生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

HepG2/ADM 細胞用含10% 的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基加入1 μg/mL 的阿霉素培養(yǎng)以保持細胞耐藥性，于37 ℃，5% 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 CCK-8 試劑盒檢測HepG2/ADM 細胞增殖活力

取分裂期細胞以5×10/mL接種在96孔板中，每孔100 μL，每個濃度梯度平行設(shè)4 個復(fù)孔。37 ℃，5% 濃度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換用新鮮DMEM 稀釋的含尾葉香茶菜丙素培養(yǎng)基或含阿霉素培養(yǎng)基，濃度梯度為培養(yǎng)24 h，后吸出培養(yǎng)基，加入濃度為10% 的含CCK-8 的新鮮的無血清DMEM，培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光值。按下列公式計算各組藥物對細胞的抑制率（inhibition rate，IR）=（1－藥物組OD 值/細胞對照組OD值）×100%。實驗重復(fù)3次結(jié)果取平均值。

1.5 細胞周期實驗

將HepG2/ADM 細胞接種于六孔板中，密度為5×10個/毫升，生長密度達到70% 時加入混有尾葉香茶菜丙素的新鮮培養(yǎng)基，分為四組：空白組，40 μmol/L 組、60 μmol/L 組、80 μmol/L組。培養(yǎng)24 h后收集細胞加入按1∶100濃度混合的PI 染色緩沖液，每個樣本加入500 μL 充分重懸細胞，37 ℃培養(yǎng)箱孵育25 min，上機檢測。實驗重復(fù)3次結(jié)果取平均值。

1.6 流式細胞儀檢測HepG2/ADM 細胞凋亡

分裂期HepG2/ADM 細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)至密度70%后更換新鮮培養(yǎng)基并加入K，濃度分別為0、40、60、80 μmol/L。24 h 后收集細胞并用PBS 洗滌兩次，1 200 r/min，3 min。吸出PBS 后每孔加入Bind?ing Buffer 500 μL 重懸細胞，再加入5 μL Annexin VFITC 混合均勻，最后加入5 μL Propidium IAide。將細胞充分吹打散開后放入培養(yǎng)箱中37 ℃孵育15～30 min，取出后置于冰上，上機測定其凋亡率，重復(fù)3次取平均值。

1.7 Transwell 小室實驗

消化收集分裂期的細胞，通過細胞計數(shù)吸取5 000 個細胞加入到小室中，其中上室200 μL 混有細胞的無血清培養(yǎng)基，下室500 μL 含有10% 血清的培養(yǎng)基。24 h 后停止實驗，無水乙醇固定10 min，1% 濃度的結(jié)晶紫染色10 min，PBS 清洗兩次每次8 min，之后進行常光拍照。實驗重復(fù)3次結(jié)果取平均值。

1.8 細胞平板劃痕實驗

細胞接種于6 孔板，密度為5×10個/mL，待生長到密度90% 時用10 μL 白色槍頭劃線，每組畫三條，用PBS清洗兩次洗去浮起的細胞，加入混有尾葉香茶菜丙素的無血清培養(yǎng)基，設(shè)置四組為空白con 組、尾葉香茶菜丙素40 μmol/L組、60 μmol/L 組、80 μmol/L 組。在0、24、48 h 分別進行拍照記錄。

1.9 實時熒光定量PCR

尾葉香茶菜丙素處理HepG2/ADM 細胞后24 h 提取RNA，之后RNA 反轉(zhuǎn)為DNA，預(yù)變性95 ℃3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸30 s，總共40 個循環(huán)；之后69 ℃終延伸1 min。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

六孔板中細胞生長在70% 時將培養(yǎng)液換為混有尾葉香茶菜丙素的新鮮培養(yǎng)基，尾葉香茶菜丙素濃度為40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸出舊培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 次加入RIPA 裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑=1∶100），每孔加入200 μL。用細胞刮將細胞刮下后轉(zhuǎn)移至EP 管中4 ℃冰上裂解40 min，每隔10 min 用手指彈管壁使細胞充分裂解。用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，加入4X蛋白上樣緩沖液沸水煮10 min，上樣跑膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉或5%BSA 封閉，一抗4 ℃孵育過夜，1%TBST 洗膜3 次，二抗常溫孵育70 min，洗膜3 次，上機顯色拍照。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件，計量資料采用

x ± s，

組間比較采用LSD-

t

檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尾葉香茶菜丙素可抑制HepG2/ADM 細胞的生長活力

為測定尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞生長活力的影響，使用CCK-8 試劑盒測定，實驗顯示加入阿霉素濃度達到1.0 mg/mL 時對HepG2/ADM 細胞的抑制率只有26.5%（

n

=3），而加入尾葉香茶菜丙素后肝癌細胞HepG2/ADM 細胞生長活力下降明顯（圖1），說明尾葉香茶菜丙素可抑制HepG2/ADM細胞生長活性且呈濃度依賴性，IC50為（62.97 ±2.81）μmol/L（

n

=3）。同時，也表明尾葉香茶菜丙素對耐藥ADM 的HepG2 細胞具有抑制作用。

圖1 尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞活力的影響（24 h）：A為尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞抑制率；B為阿霉素對HepG2/ADM細胞的抑制率

2.2 尾葉香茶菜丙素將HepG2/ADM 細胞周期阻滯在G2 期

通過流式細胞儀測定HepG2/ADM 細胞在增殖不同時期的數(shù)目比例分布，結(jié)果表明隨著尾葉香茶菜丙素濃度，HepG2/ADM 細胞被阻滯到G2 期，G2 期比例在空白組、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L 分別增加（11.883±2.551）% 、（21.756±1.737）% 、（30.152±1.964）% 、（37.024±2.727）%（

n

=3），呈現(xiàn)濃度依賴性的趨勢（

F

=1.821，2.380，2.516，

t

=6.189，5.221，4.287，

P

=0.041，0.033，0.0017）。

2.3 尾葉香茶菜丙素促進HepG2/ADM 細胞凋亡

利用流式細胞術(shù)分析不同濃度尾葉香茶菜丙素對細胞凋亡的影響，實驗結(jié)果顯示，在尾葉香茶菜丙素濃度分別為0、40、60、80 μmol/L 時，HepG2/ADM 細胞凋亡率分別為（6.267±1.317）%、（15.10±1.265）%、（19.77±1.963）%、（25.614±2.301）%（

n

=3），凋亡率呈遞增趨勢，說明尾葉香茶菜丙素能誘導(dǎo)HepG2/ADM 細胞凋亡，且呈濃度依賴性。Western blotting 結(jié)果顯示Bcl-2 家族中促凋亡蛋白Bax 蛋白灰度值在尾葉香茶菜丙素濃度分別為0、40、60、80 μmol/L 時 分 別 為1、（1.24±0.072）、（1.63±0.128）、（2.19±0.183），說明Bax 蛋白表達上升，抑凋亡蛋白Bcl-2 在尾葉香茶菜丙素濃度分別為0、40、60、80 μmol/L 時 別 為1、（0.62±0.049）、（0.36±0.036）、（0.23±0.028），表達下降，顯示尾葉香茶菜丙素通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達發(fā)揮促凋亡作用（

F

=2.057，1.553，5.785，

t

=4.757，12.58，10.07，

P

=0.0089，0.002，0.005）。見圖2。

圖2 尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞凋亡的促進作用

2.4 尾葉香茶菜丙素抑制HepG2/ADM 細胞遷移

為了研究尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM 細胞遷移的影響，研究進行了Transwell 小室實驗和平板劃痕愈合實驗，發(fā)現(xiàn)在K 濃度為0、40、60、80 μmol/L時，穿過膜的細胞數(shù)量分別為［（832.56±38.91）、（617.85±26.71）、（436.23±31.52）、（361.69±27.13）］個，在平板劃痕愈合實驗中發(fā)現(xiàn)，24 h時劃痕面積在K 濃度為0、40、60、80 μmol/L 分別是0 h 時的（0.68±0.012）、（0.83±0.021）、（0.90±0.019）、（0.95±0.010）倍；48 h 時劃痕面積在K 濃度為0、40、60、80 μmol/L分別是0 h 時的（0.41±0.022）、（0.56±0.024）、（0.72±0.031）、（0.88±0.016）倍，說明隨著尾葉香茶菜丙素濃度的升高，小室中穿過膜的細胞數(shù)量越來越少，劃痕愈合的速率也呈濃度依賴性的變慢，說明尾葉香茶菜丙素可以抑制HepG2/ADM 細胞的遷移（t=12.61，9.82，P=0.003，0.005）。見圖3。

圖3 尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞遷移的影響：A為Tran?swell小室實驗；B為平板劃痕愈合實驗

2.5 尾葉香茶菜丙素能抑制MDR1 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達

為了檢測尾葉香茶菜丙素是否調(diào)控耐藥基因的表達，我們首先進行了實時熒光定量PCR，表1 為引物合成表，結(jié)果顯示，BCRP、MRP1、MRP2 都未受到顯著調(diào)節(jié)，而在尾葉香茶菜丙素濃度為60 μmol/L 時MDR1 基因表達下調(diào)為空白對照的（0.255±0.013）倍（

t

=20.41，

P

=0.017）（

n

=3）。West?ern blotting 結(jié)果顯示MDR1 蛋白的表達量也受到了抑制，在尾葉香茶菜丙素處理濃度在80 μmol/L 時MDR1蛋白的濃度為空白對照組的（0.352±0.089）倍（

t

=19.87，

P

=0.008）（

n

=3），說明尾葉香茶菜丙素在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平都抑制了MDR1 的表達。見圖4。

表1 引物設(shè)計和合成

圖4 尾葉香茶菜丙素對ABC超家族轉(zhuǎn)運蛋白mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響

2.6 尾葉香茶菜丙素抑制能p-PTEN 和p-AKT 的表達

另外，Western blotting 結(jié)果顯示（圖5），尾葉香茶菜丙素處理HepG2/ADM 細胞后p-AKT 蛋白表達量下降在80 μmol/L 時p-AKT 蛋白表達量降至空白組的（0.231±0.036）倍（

t

=15.49，

P

=0.002），p-PTEN表達量上升，在60 μmol/L時上升為空白組蛋白表達量的（1.523±0.126）倍（

t

=7.189，

P

=0.002）且這些蛋白全部以濃度依賴性的方式受到調(diào)節(jié)。

圖5 尾葉香茶菜丙素對PENT-AKT通路蛋白的調(diào)控

3 討論

肝癌耐藥性一直是其化療效果不佳和預(yù)后較差的重要原因，本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素在1 mg/mL（184 μmol/L）時對HepG2/ADM 細胞耐藥株的生長抑制率只有26.5%，而尾葉香茶菜丙素（Kamebakurin）對肝癌細胞HepG2/ADM細胞生長活力有強抑制作用，其IC50 值為62.97 μmol/L，尾葉香茶菜丙素對HepG2/ADM細胞的毒性要高于一線藥物ADM。

在細胞凋亡主動中Bcl2 家族發(fā)揮重要作用，尾葉香茶菜丙素能誘導(dǎo)HepG2/ADM 細胞凋亡，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示尾葉香茶菜丙素通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達并抑制抑凋亡蛋白Bcl-2 表達；尾葉香茶菜丙素可將HepG2/ADM 細胞周期阻滯在G2期，說明尾葉香茶菜丙素使細胞DNA 損傷，細胞G2檢查點將受損細胞阻滯在G2 期無法進行后續(xù)有絲分裂，是HepG2/ADM 細胞發(fā)生凋亡和生長活力下降的主要原因之一；癌細胞的高遷移能力，是癌癥難以治愈的重要原因之一，我們的研究表明尾葉香茶菜丙素具有很強的抑制HepG2/ADM 細胞遷移的能力。MDR1在癌細胞中過表達是腫瘤化療成功的主要障礙之一，在腫瘤病人中，MDR1 將化療藥物排出細胞外，使藥物療效下降。在本研究中，尾葉香茶菜丙素處理細胞后，MDR1 在mRNA 和蛋白水平上顯著降低，逆轉(zhuǎn)了HepG2/ADM 細胞耐藥株將藥物泵出細胞的能力，說明尾葉香茶菜丙素具有逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM 細胞耐藥的潛力，其部分功能通過抑制MDR1 基因和蛋白的表達發(fā)生，可能這是HepG2/ADM 細胞對尾葉香茶菜丙素要比阿霉素更敏感的原因之一。AKT 通路與很多腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其異常激活會促進腫瘤的生長增殖以及遷移侵襲等，PTEN 是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，作為AKT 通路的負調(diào)控因子其磷酸化水平的升高會抑制p-AKT 的激活從而抑制細胞增殖和遷移。通過Western blotting 實驗顯示尾葉香茶菜丙素處理細胞后，p-AKT含量下降且AKT通路上游蛋白p-PTEN表達上升最終抑制AKT通路的激活。

綜上所述，尾葉香茶菜丙素可能通過抑制MDR1 蛋白表達從而逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM 細胞對藥物的敏感性，主要通過上調(diào)p-PTEN抑制p-AKT的激活從而促進HepG2/ADM 細胞的凋亡并抑制其遷移能力，說明尾葉香茶菜丙素具有很好的抑制肝癌耐藥的功效和潛力。