張子雄 蔣影 張家春 戚燕強(qiáng) 孫超

摘? ? 要：以白及為試驗(yàn)材料，采用優(yōu)化的CTAB法和試劑盒法提取白及葉片的基因組DNA。結(jié)果表明：優(yōu)化的CTAB法提取出的DNA檢測濃度值為252.8～664.8 ng/μL，試劑盒法的檢測濃度值為31.7～52.3 ng/μL。證明優(yōu)化CTAB法和DNA試劑盒法都能獲得基因組DNA的良好完整性和高純度。

關(guān)鍵詞：白及;DNA提取;優(yōu)化的CTAB;試劑盒法

文章編號：1005-2690（2021）17-0022-02? ? ? ?中國圖書分類號：R282.71? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

白及（Bletilla striata （Thunb.）H.G.Reichenbach）是蘭科白及屬的多年生草本植物[1]，主要分布于我國貴州、廣西、云南、湖南省等多數(shù)地區(qū)[2-4]?；蚪MDNA承載著植物的基本遺傳物質(zhì)和遺傳信息，要進(jìn)行其后續(xù)的分子層面的生物學(xué)試驗(yàn)，提取一定數(shù)量、高質(zhì)量的DNA樣品是必不可少的。根據(jù)不同植物種的生物特性和基因組DNA的不同，進(jìn)行提取方法的優(yōu)化是進(jìn)行分子標(biāo)記試驗(yàn)的第一步也是最為關(guān)鍵的一步[5-6]。由于白及的葉片中富含有多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物，不容易去掉雜質(zhì)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，總結(jié)出此試驗(yàn)方法步驟。

1? ?結(jié)果與分析

1.1? ?DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測分析

使用優(yōu)化的CTAB法提取白及基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，DNA電泳條帶整齊清楚明顯，沒有拖帶，DNA的條帶均高于Marker的最高條帶。使用DNA提取試劑盒法提取結(jié)果如圖2，條帶也依然清晰明亮。使用傳統(tǒng)CTAB法如圖3，會發(fā)現(xiàn)有些孔中電泳條帶有拖帶現(xiàn)象，有些孔中提取的DNA電泳條帶很弱甚至無條帶。

1.2? ?基因組DNA濃度和純度檢測分析

使用優(yōu)化的CTAB法提取白及基因組DNA濃度和純度檢測結(jié)果見表1。結(jié)果中所含有的RNA、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)的雜質(zhì)、殘留的鹽或小分子雜質(zhì)較少。DNA檢測濃度值在252.8～664.8，表明與試劑盒法提取相比提取濃度更高。使用DNA提取試劑盒法提取的結(jié)果見表2。所提取DNA的結(jié)果中所含有的RNA、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)的雜質(zhì)更少。DNA檢測濃度值在31.7～52.3，表明DNA的提取濃度恰好滿足后續(xù)PCR分子試驗(yàn)的濃度標(biāo)準(zhǔn)要求。

2? ?試驗(yàn)材料與方法

2.1? ?材料

以種植于貴州省植物園藥用植物試驗(yàn)基地的白及植株的尖端嫩葉為材料。

2.2? ?方法

2.2.1? ?優(yōu)化的CTAB法提取基因組DNA

優(yōu)化的CTAB法試驗(yàn)步驟如下：①加入液氮，加白及頂端新鮮嫩葉迅速研磨，放入2 mL離心管中，加1.5 mL4 ℃預(yù)冷的STE裂解液（NaCl 0.25 mol/L，EDTA（pH值8.0）50 mol/L，Tris-HCl （pH值8.0）0.2 mol/L， β-巰基乙醇1%，2 gpvp）。②離心時(shí)間為6 min，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，棄上層清液;加1.5 mL 4 ℃預(yù)冷STE裂解液，充分混勻。離心6 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，棄上層清液。③加65 ℃預(yù)熱的1 mL的4×CTAB提取緩沖液，65 ℃水浴45 min，其間每隔15 min震蕩1次。④4 ℃離心8 min，轉(zhuǎn)速11 000 r/min;取800 μL上清液，加到2 mL的離心管中。再加入與之等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）溶液，輕微顛倒混勻3 min。⑤4 ℃中離心8 min，轉(zhuǎn)速11 000 r/min;抽取600 μL的上清液，加到2 mL離心管中，加入等體的氯仿/異戊醇（24∶1）溶液，顛倒混勻3 min。⑥重復(fù)⑤。⑦吸取200 μL的上清液，加入1.5 mL的離心管之中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，輕微震蕩，置于-20 ℃沉淀0.5～1 h。⑧4 ℃離心6 min，轉(zhuǎn)速11 000 r/min，4 ℃預(yù)冷70%乙醇清洗兩次，加入90 μL TE緩沖液溶解沉淀，加入10 μL RNaseA酶（10 mg/mL），37 ℃水浴鍋中水浴30 min;放入-20 ℃保存。

2.2.2? ?基因組DNA質(zhì)量的檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照張子雄等（2017）方法。核酸蛋白分析儀檢測，參照張子雄等（2017）方法。

3? ?討論

劉亭等（2014）是直接進(jìn)行水浴，但試驗(yàn)在水浴之前加入STE裂解液進(jìn)行雜質(zhì)的清洗，可以更好地進(jìn)行后續(xù)步驟;且試驗(yàn)進(jìn)行了兩次氯仿/異戊醇（24∶1）溶液的添加，去除雜質(zhì)更徹底。周延清等（2005）利用SDS提取液提取的DNA雜質(zhì)更多，無法去除葉片中的酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物。在張子雄等（2017）對柱花草DNA提取的基礎(chǔ)上改變了裂解液的使用，針對白及能很好地去除雜質(zhì)。

DNA試劑盒法所提取的DNA結(jié)果純度很高，雜質(zhì)少。但此方法提取的DNA濃度只是剛好達(dá)到后續(xù)PCR試驗(yàn)中DNA模板濃度30 ng/μL的最低標(biāo)準(zhǔn)要求，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于優(yōu)化的CTBA法的提取結(jié)果。每個處理提取量太少，只適合滿足檢測小劑量試驗(yàn)使用，不適合大劑量多組次的試驗(yàn)使用。優(yōu)化的DNA提取分離方法是在之前學(xué)者們的方法上經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，針對貴州道地藥材白及這一植物葉片材料加以改進(jìn)、優(yōu)化、總結(jié)。不僅在很大程度上節(jié)省了工作試驗(yàn)時(shí)間，而且濃度、純度均滿足后續(xù)大劑量多組次的分子試驗(yàn)要求，為后續(xù)順利地開展分子試驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。兩種方法各有利弊，也各有其用途，DNA試劑盒法適用于少組數(shù)的檢測試驗(yàn)，優(yōu)化的CTAB法適用于多組數(shù)、大劑量的試驗(yàn)需求[7-8]。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 李偉平，何良艷，丁志山.白及的應(yīng)用及資源現(xiàn)狀[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（1）：158.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

[ 3 ] 任華忠，何毓敏，楊麗.白及化學(xué)成分其藥理活性研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（2）：134

[ 4 ] 俞林花，聶緒強(qiáng)，潘會君，等.白及多糖對糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的作用研究[J].中國中藥雜志，2011，36（11）：1487.

[ 5 ] 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[ 6 ] 劉亭，雷諝婷，羅阿東，等.白及DNA提取方法研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（12）：119-123.

[ 7 ] Fu L K，Jin J M.China plant red data book：rare and endangered plants （Vol.1）[M].Beijing：Science Press，1992.

[ 8 ] 唐燕瓊，吳紫云，郭建春，等.柱花草DNA提取及ISSR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2008（3）：352-357.