江小艷，林旭埜

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東廣州 510000；2.海泰達生物科技（廣州）有限公司，廣東廣州 510000）

鴿新城疫（Newcastle Disease），俗稱鴿瘟，病原屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽副黏病毒屬的禽Ⅰ型副黏病毒（APMV-Ⅰ），RNA 病毒，病毒基因組排列順序為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼核衣殼蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、融合蛋白、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白和大蛋白[1]。PPMV-Ⅰ有血凝活性，中強毒株在體外細胞培養(yǎng)中可在體外成纖維細胞（CEF）中增殖，通過膜融合而感染宿主細胞，出現(xiàn)明顯的細胞融合、聚集、死亡脫落等細胞病變（CPE）[2]。本研究對廣東省清遠市某鴿場里疑似發(fā)生鴿瘟的病鴿，采集腦、肝臟、胰臟組織，進行病原分離和鑒定，分析其F、HN 基因的分子特征和基因型，測定各代血凝價及細胞半數(shù)感染量，為今后鴿新城疫分子流行病學研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

廣東省清遠市某鴿養(yǎng)殖場發(fā)病的美王鴿，具有嚴重的神經(jīng)癥狀，不停扭頸，瀉痢，糞便稀薄呈黃綠色。

1.2 主要試劑

Primer Star 酶，pMD19-T質(zhì)粒（Takara）；0.25%胰蛋白酶消化液（北京索萊寶科技有限公司）；新生牛血清（內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 干粉（Gibco）；柱式病毒RNA 提取試劑盒（Magen）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞）。

1.3 主要儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Panasonic）；倒置顯微鏡（廣州粵顯光學儀器）；PCR 儀器（Biometra）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技）；全自動家用型孵化器（德州市維謙孵化設(shè)備制造廠）：離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 實驗動物

SPF 種蛋（大華農(nóng)禽蛋有限公司）。

1.5 實驗病料

廣東省清遠市某鴿養(yǎng)殖場發(fā)病的美王鴿，具有嚴重的神經(jīng)癥狀，不停扭頸，瀉痢，糞便稀薄呈黃綠色。

1.6 實驗方法

1.6.1 病鴿組織處理

將無菌采集的不同組織放于-20℃環(huán)境，反復(fù)凍融3 次后與滅菌PBS 溶液1:5 研磨，8000g 離心5min，0.22μm 濾器過濾上層清澈液體到滅菌離心管中，存放于-20℃環(huán)境。

1.6.2 病毒分離培養(yǎng)和血凝（HA）實驗

將分離的鴿的不同組織的處理液接種雞胚，0.2ml/個。棄去24h 內(nèi)死亡的胚，每日觀察4 次。收集尿囊液做HA 實驗，觀察死胚有無癥狀。根據(jù)文獻[3]，對收集的各代尿囊液用PBS 緩沖液在V 型96 孔板中進行2 倍連續(xù)倍比稀釋，用1%紅細胞懸液進行血凝試驗，測定血凝價。

1.6.3 病毒測序和分析

參考GeneBank 中已公布的鴿副黏病毒和雞新城疫病毒F、HN 基因，分別設(shè)計引物。對有血凝現(xiàn)象的尿囊液，用柱狀病毒RNA 提取試劑盒提取RNA，擴增的F、HN 基因連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，挑取疑似陽性的單菌落，送測。測序結(jié)果與GeneBank 中已發(fā)表的鴿副黏病毒、新城疫F 基因的核苷酸序列進行同源性分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

1.7 1 ～10 代TCID50 測定

1.7.1 制備CEF

去除胚腦、喙、翅膀、爪、內(nèi)臟后，用滅菌PBS 溶液清洗3 次，剪成1 mm3大小碎塊，用PBS清洗碎組織直至上清清澈無血液殘留，加入10 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化組織塊約15 min，每3 min 用腕部輕輕轉(zhuǎn)動并觀察，直至組織塊呈現(xiàn)通透、周圍毛絨絨的狀態(tài)，棄去胰酶液，加入2 ml 含有10% 血清的1×MEM 細胞營養(yǎng)液終止消化，棄去，補加15 ml 細胞營養(yǎng)液，輕輕吹散組織，靜置30 s，吸取上層細胞懸液，8 層滅菌紗布過濾，再次補加15 ml 細胞營養(yǎng)液，吹散、過濾，反復(fù)吹散、過濾4 次后，臺盼藍染色1 min，計數(shù)，制成終濃度為每毫升濾液中含活細胞1×106個，24 h 內(nèi)接種病毒。

1.7.2 接毒

將每代收集的病毒尿囊液用不含血清的1xMEM作10 倍系列稀釋，稀釋釋至10-1-10-9。棄去96 孔板內(nèi)細胞營養(yǎng)液，吸取100μl 病毒稀釋液到96 孔細胞培養(yǎng)板，空白對照加入100μl 細胞維持液（含有2%血清的1xMEM），每個病毒稀釋度做6 個重復(fù)，設(shè)置4 個空白對照，做好標記，放入細胞培養(yǎng)箱，吸附1h 后，補加100μl 細胞維持液，放到細胞培養(yǎng)箱，每日早晚觀察并記錄細胞病變，按Reed-Muench 法計算1 ～10 代病毒細胞半數(shù)感染量。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和解剖觀察

病鴿臨床表現(xiàn)為明顯的神經(jīng)癥狀，頭頸扭曲，拉綠色稀糞，剖檢器官可見明顯充血。

2.2 病毒分離培養(yǎng)和紅細胞凝集試驗

接種病毒死亡雞胚可見明顯全身充血，水腫，頭頸扭曲癥狀，對照組雞胚生長發(fā)育正常）。1 ～10代血凝實驗結(jié)果表明1 ～5 代毒血凝價較低、不穩(wěn)定（4 ～7log2），6 代以后血凝價穩(wěn)定在7 ～8log2。

2.3 目的基因的擴增、同源性分析

2.3.1 F、HN 基因擴增及進化樹分析

F、HN 基因序列擴增產(chǎn)物，經(jīng)電泳跑膠后，可見預(yù)期大小目的條帶。經(jīng)Lasergene 軟件分析顯示，F(xiàn) 基因開放閱讀框為1662 bp，F(xiàn) 蛋白的裂解位點氨基酸序列為：112R-R-Q-K-R-F117，HN 基因開放閱讀框為1716 bp。

2.3.2 同源性分析及遺傳進化樹繪制

分離株與中國主要流行的雞源基因Ⅶ型NDV 毒株HA-9-06-Ch 及鴨源NDV10-006 株的F 基因核苷酸序列同源性為86.7%、70%，與疫苗株La Sota、Mukteswar 的同源性分別為83.9%、85.3%，而與鴿 源 的Qinghai/1344/2017、China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 株同源性分別為99.2%、98.8%、98.5%。

分離株P(guān)PMV-GDQY與鴿源的Qinghai/1344/2017 株親緣關(guān)系最近，與鴿參考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 在進化樹上處于同一個分支，屬于基因Ⅵ型。

2.4 病毒組織TCID50 測定

圖1（A）所示為試驗孔，可看見明顯的細胞融合、圓縮、聚集、細胞死亡脫落等病變現(xiàn)象；圖1（B）所示為對照孔雞胚成纖維細胞生長情況，細胞貼壁生長，呈長梭形，規(guī)則排列。1 ～4 代TCID50分別為：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分別為：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml。

圖1 細胞觀察

3 討論

臨床觀察病鴿具有明顯神經(jīng)癥狀、腹瀉，剖檢氣管嚴重充血。從病鴿體內(nèi)分離到的病毒在雞胚上生長良好，可以凝集雞紅細胞，F(xiàn)、HN 基因序列分析表明，F(xiàn) 蛋白裂解位點序列為112R-R-Q-KR-F117(112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117)，HN 基 因編碼571 個氨基酸，在不含胰酶的原代雞胚成纖維細胞上健康生長均符合強毒株基因特征。根據(jù)F 基因核苷酸序列遺傳距離分析，PPMV-GDQY 株與Qinghai/1344/2017 株親緣關(guān)系最近，與鴿參考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 同屬于一個分支，同源性分別為99.2%、98.8%、98.5%，屬于基因Ⅵ型。分離株1 ～5 代血凝價較低、不穩(wěn)定，傳到6 代后，血凝價穩(wěn)定在7 ～8log2，雞胚死亡時間集中穩(wěn)定在60 ～72 h，表明分離株6 代以后的培養(yǎng)情況比較穩(wěn)定。1 ～4 代TCID50分別為：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分 別 為：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml，表明分離的毒株TCID50較高且5 代以后的分布在10-8.2～10-8.59/0.1 ml。