楊吉蘭, 徐 勝, 馬長樂, 韓志松, 李 奪, 李 巖, 王 楠, 王義婧, 何興元,

1 西南林業(yè)大學園林園藝學院, 昆明 650224 2 中國科學院森林生態(tài)與管理重點實驗室, 中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所, 沈陽 110016 3 遼寧省農(nóng)業(yè)科學院沙地治理與利用研究所, 阜新 123099 4 中國科學院沈陽樹木園, 沈陽 110016 5 國家林業(yè)局西南風景園林工程技術研究中心, 昆明 650224 6 北京綠京華生態(tài)園林股份有限公司, 北京 102209

臭氧(O3)是地球大氣成分中的一種微量氣體,其主要集中在平流層,對流層中的含量僅占整個大氣層O3總量的10%左右[1]。然而,近年來的經(jīng)濟快速發(fā)展和工業(yè)能源大量消耗引起臭氧前體物(NOx、 VOCs)的排放量增加,這使得對流層臭氧濃度不斷升高。在我國很多地區(qū)O3濃度已成顯著增加趨勢,特別是在經(jīng)濟發(fā)展迅速、人口密集的地區(qū),O3污染更為嚴重[2- 3]。2019年《中國環(huán)境公告》顯示,全國338個地級及以上城市的O3日最大小時平均第90百分位濃度已達到了69 nmol/mol[4],超過了O3對植物造成影響的臨界值[5]。因此,城市近地表O3濃度升高會對城市綠地及園林植物的生長及發(fā)育產(chǎn)生潛在風險或脅迫[6- 7]。

研究表明,O3濃度過高一方面會引起植物氣孔關閉,限制CO2進入植物葉片[8],降低葉綠素含量,進而引起凈光合速率下降[9]；另一方面,O3的強氧化作用,可引起植物體內(nèi)代謝紊亂及傷害癥狀,增加細胞膜透性,導致大量的活性氧積累,引起細胞膜脂過氧化反應[10]。

近年來,國內(nèi)外學者在O3對農(nóng)作物、樹木及草坪草生理生態(tài)的影響方面做了大量研究[11- 15],但在高濃度O3對觀賞草的影響方面鮮有研究和報道。觀賞草是一類色彩豐富、形態(tài)美麗、主要觀賞莖桿和葉叢的草本植物的統(tǒng)稱,以禾本科為主,其次是莎草科[16]。觀賞草作為當前新興的一類園林景觀設計新材料,花序獨特,易栽培,病蟲害少,抗逆性強,適于粗放管理等特點,在各種園林生態(tài)景觀配置中具有較高的觀賞性和實用性[17- 19]。白穗狼尾草(Pennisetumalopecuroides′White′)和拂子茅(Calamagrostisepigeios)為多年生禾本科草本植物,因二者形態(tài)優(yōu)美,根系發(fā)達,株叢分枝能力強,常常被作為景觀草在園林綠化、生態(tài)修復治理等方面被大量應用。因此,本實驗采用開頂式氣室模擬O3濃度升高,通過氣體熏蒸,研究不同高濃度O3處理下這兩種觀賞草葉片的逆境生理特征,分析和比較二者的耐O3能力,為O3污染下這類植物的引種栽培及其在園林生態(tài)景觀中的應用等方面提供技術指導及科學依據(jù)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究地區(qū)概況與試驗設計

試驗地位于沈陽城區(qū)商業(yè)文化中心中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所樹木園內(nèi)(123°26′E,41°46′N),地勢平坦,土層深厚肥沃,屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候,四季分明,雨熱同季。試驗主要設備為正八邊形開頂箱(OTC,北京前景惠邦控制技術有限公司設計)以及與之配套的通氣、通風設備,OTC內(nèi)設有O3發(fā)生器(XH- 2000,國產(chǎn))、O3傳感器(S- 905,新西蘭)、溫濕度傳感器及數(shù)據(jù)分析與自動控制系統(tǒng)(CR- 800,Campbell Scientific Inc., 美國,北京華益瑞科技有限公司進口代理)。實驗設置一個對照組(CK),自然O3濃度約40 nmol/mol；三個高O3濃度(EO)梯度組：80 nmol/mol(EO- 80)、120 nmol/mol(EO- 120)和160 nmol/mol(EO- 160)。

試驗選取白穗狼尾草和拂子茅作為研究對象,該試驗材料由北京綠京華生態(tài)園林股份有限公司提供,采用上口徑28 cm,高30 cm的聚乙烯塑料盆進行種植,于2019年5月開始進行室外緩苗,8月5日挑選長勢均勻一致的盆栽白穗狼尾草和拂子茅各24盆,隨機分為4組,每組6盆,分別放入CK、EO- 80、EO- 120和EO- 160的開頂箱內(nèi)進行熏蒸。從8月5日開始,每天09:00—17:00往開頂箱中通氣(陰雨天等惡劣天氣停止熏蒸),在試驗期間各開頂箱每日8小時平均O3濃度,如圖1所示。整個處理期OTCs內(nèi)管理方法一致,水肥等條件控制一致。試驗于實際熏蒸的第7天(8月22日)、14天(8月31日)、21天(9月11日)測定葉片的光合氣體交換參數(shù)及各項生理指標。

圖1 試驗期間不同處理下開頂箱內(nèi)每日8 h臭氧濃度均值Fig.1 Average daily ozone concentration of 8 hours in open top chambers under different treatments during the experiment

1.2 觀測指標及方法

1.2.1光合氣體交換參數(shù)的測定

于實際熏蒸的第7、14、21天分別測定葉片的光合氣體交換參數(shù),選擇晴朗天氣的09:00—12:00測定。選取無葉片遮擋,挑選健康無病蟲害、大小均勻、葉色一致的,頂端向下第3—5個成熟葉片的中段部分,采用LI- 6400便攜式光合測定儀(固定紅藍光源,設定光合有效輻射PAR=1200 μmol m-2s-1)測定凈光合速率Pn和氣孔導度gs。每個處理的光合氣體交換參數(shù)指標測定3個葉片,每片葉子計測10次。

1.2.2生理指標的測定

光合色素含量采用乙醇混合液法[20]；丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸(TBA)法[20]；可溶性蛋白含量：采取考馬斯亮藍染色法[20]；超氧化物歧化酶(SOD)活性：采用氮藍四唑法[21]；POD活性：采用愈創(chuàng)木酚比色法[22]。不同處理下,各生理指標進行3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)、計算平均值和標準差,結合SPSS 22.0軟件,運用單因素方差分析(one-way ANOVA)的Duncan多重比較法,分別對同一時間不同濃度O3處理的各項生理指標進行分析,比較各指標的處理與對照間差異顯著性(顯著性水平設為0.05),運用重復測量分析時間與O3濃度之間對各指標的交互作用,使用Origin 9.1軟件制圖。計算各指標的變化率=處理值-對照值)/對照值,對變化率進行主成分分析[23],比較植物的耐O3性。

2 結果與分析

2.1 高濃度O3脅迫下兩種園林觀賞草葉片光合色素含量變化

圖2 O3濃度升高對白穗狼尾草和拂子茅葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig.2 Effects of elevated O3 concentrations on the contents of chlorophyll and carotenoid in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios 柱狀圖上不同小字母表示同一處理時間不同O3濃度處理之間差異顯著,不同大寫字母表示同一O3濃度處理不同處理時間之間差異顯著(P <0.05);* P<0.05; ** P<0.01

如圖2所示,處理7 d、14 d時,白穗狼尾草葉片葉綠素總量在EO- 120和EO- 160熏蒸下較CK呈顯著下降趨勢；處理21 d時,在EO- 80、EO- 120和EO- 160下較CK均下降顯著,其中EO- 160下降幅度為46%,達到最大(P<0.05)。與CK相比,處理14 d時EO- 160下拂子茅葉片葉綠素總量顯著下降22.8%(P<0.05)；處理21 d時,EO- 120和EO- 160熏蒸使得葉綠素含量分別較CK顯著下降23.3%和26.4%(P<0.05)。白穗狼尾草葉片類胡蘿卜素含量隨O3濃度升高,與CK相比呈下降趨勢,在處理7 d時EO- 160熏蒸顯著下降了22.9%(P<0.05),但在處理14 d,21 d時變化不顯著。拂子茅葉片類胡蘿卜素含量在處理21 d時,與CK相比,EO- 80、EO- 120和EO- 160熏蒸下分別顯著下降20.1%、26.0%和33.9%(P<0.05)。O3和處理時間單獨對兩種觀賞草葉綠素總量的影響存在極顯著差異(P<0.01),二者交互僅對拂子茅葉綠素總量的下降影響顯著(P<0.05)。

2.2 高濃度O3脅迫下兩種園林觀賞草葉片光合氣體交換參數(shù)變化

不同濃度的O3熏蒸均使得兩種觀賞草葉片Pn和gs較CK呈下降趨勢,這表明O3脅迫抑制了兩種植物的光合作用。如圖3所示,與CK相比,處理7 d、14 d和21 d時,EO- 80、EO- 120和EO- 160熏蒸下白穗狼尾草葉片Pn均呈顯著下降趨勢,其中在EO- 160處下降幅度分別達到最大,為84.4%、50.3%和61.3%(P<0.05)。拂子茅葉片Pn在處理7 d、14 d時,EO- 120和EO- 160熏蒸下較CK均呈顯著下降趨勢；處理21 d時,EO- 160下Pn較CK顯著下降43.0%(P<0.05)。白穗狼尾草葉片gs在處理7 d、14 d時,與CK相比,EO- 120和EO- 160熏蒸下gs呈顯著下降趨勢；處理21 d時,EO- 160下降27.3%(P<0.05)。拂子茅葉片gs在處理7 d時,EO- 120和EO- 160下較CK分別顯著下降57.0%和59.1%(P<0.05)；處理14 d時,gs較CK分別顯著下降32.8%和41.8%(P<0.05)；處理21 d時,EO- 160下gs顯著下降28.2%(P<0.05)。O3、時間及二者交互對白穗狼尾草和拂子茅葉片Pn和gs均存在極顯著影響(P<0.01)。

圖3 O3濃度升高對白穗狼尾草和拂子茅葉片凈光合速 率(Pn)和氣孔導度(gs)的影響Fig.3 Effects of elevated O3 concentrations on net photosynthetic rate (Pn) and stomatal conductance (gs) in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.3 高濃度O3脅迫下兩種園林觀賞草葉片MDA含量變化

如圖4所示,與CK相比,在EO- 160處理7 d、14 d和21 d時,白穗狼尾草葉片MDA含量分別顯著上升72.7%、129.9%和30.2%(P<0.05)。高濃度O3脅迫對白穗狼尾草產(chǎn)生嚴重的氧化傷害,并隨處理時間延長,膜脂過氧化程度增強。在整個試驗期間,不同濃度O3熏蒸下,拂子茅葉片MDA含量與CK相比呈上升趨勢,但無顯著差異(P>0.05),說明拂子茅對O3脅迫有一定的抗性。

圖4 O3濃度升高對白穗狼尾草和拂子茅葉片丙二醛(MDA)含量的影響Fig.4 Effects of elevated O3 concentrations on malondialdehyde (MDA) content in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.4 高濃度O3脅迫下兩種園林觀賞草葉片可溶性蛋白含量變化

如圖5所示,處理7 d、14 d時,在EO- 160下白穗狼尾草葉片可溶性蛋白含量較CK分別顯著下降12.5%和28.1%；處理21 d時,在EO- 120和EO- 160下分別較CK顯著下降24.2%和43.1%。拂子茅在處理14 d時,EO- 120和EO- 160下葉片可溶性蛋白含量分別較CK顯著下降9.8%和11.9%；處理21 d時,在EO- 80、EO- 120和EO- 160下分別較CK顯著下降12.0%、19.0%和22.9%。在O3濃度與時間交互作用下,前者對白穗狼尾草葉片的可溶性蛋白產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)；O3單獨處理對拂子茅葉片的可溶性蛋白產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。

圖5 O3濃度升高對白穗狼尾草和拂子茅葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of elevated O3 concentrations on soluble protein content in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.5 高濃度O3脅迫下兩種園林觀賞草葉片保護酶活性變化

由圖6可知,兩種觀賞草葉片SOD活性隨處理時間延長和O3濃度增加,均呈先升后降趨勢,POD活性呈下降趨勢。在處理7 d和14 d時,EO- 160熏蒸下白穗狼尾草葉片的SOD活性較CK顯著上升了41.5%和50.4%(P<0.05)；處理21 d時,EO- 120和EO- 160熏蒸下SOD活性較CK分別顯著下降21.6%和33.9%(P<0.05)。拂子茅在處理7 d時,EO- 120和EO- 160熏蒸使得該草葉片SOD活性較CK顯著上升117.8%和142.6%(P<0.05)；處理21 d時,EO- 160熏蒸下葉片SOD活性較CK顯著下降23.8%(P<0.05)。白穗狼尾草在EO- 160熏蒸處理7、14、21 d時,葉片POD活性較CK顯著下降28.4%、63.5%和58.9%(P<0.05)。拂子茅葉片POD活性在處理14 d時,EO- 80、EO- 120和EO- 160下分別較CK顯著下降24.2%、25.5%和35.7%(P<0.05)；處理21 d時,POD活性較CK在EO- 80、EO- 120和EO- 160下分別顯著下降19.5%、32.3%和35.3%(P<0.05)。O3、時間及二者交互作用對兩種觀賞草葉片SOD和POD活性均產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)。

圖6 O3濃度升高對白穗狼尾草和拂子茅葉片超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.6 Effects of elevated O3 concentrations on superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activities in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.6 兩種園林觀賞草對高濃度O3脅迫的抗逆性綜合評價

利用SPSS 22.0對標準數(shù)據(jù)進行主成分析,按主成分特征值大于1的原則提取2個主成分,累積貢獻率達到78.73%,很大程度上代表了原始指標信息。由表1可知,主成分1特征向量為3.96,貢獻率為49.44%,包括了葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、Pn、可溶性蛋白、POD等指標的信息；主成分2特征值為2.34,貢獻率為29.29%,包括了gs和SOD指標的信息。根據(jù)主成分的特征向量計算出這兩種觀賞草的抗逆性得分,主成分綜合得分越高,表明該植物對環(huán)境因子的脅迫反應表現(xiàn)越不敏感,即能表現(xiàn)出較好的抗逆性。反之,則表現(xiàn)敏感,抗逆性較差[24]。如表2所示,白穗狼尾草在EO-80、EO-120和EO-160濃度下的得分分別為0.92、-1.06和-2.55,拂子茅在EO-80、EO-120和EO-160濃度下的得分分別為1.15、1.05和0.49,在各濃度處理下兩種觀賞草的綜合得分拂子茅大于白穗狼尾草,表明拂子茅耐O3脅迫的能力強于白穗狼尾草。

表1 O3脅迫下兩種觀賞草逆境生理指標的特征向量

表2 兩種園林觀賞草對O3脅迫的抗逆性綜合評價

3 討論

3.1 高濃度O3脅迫對兩種園林觀賞草葉片光合特征的影響

葉綠體色素是植物光合作用的關鍵物質(zhì)和有機營養(yǎng)的基礎,其中葉綠素和類胡蘿卜是重要的光合色素,光合色素含量下降意味著葉片光合能力降低[25- 26]。一般來說,高濃度O3脅迫會對植物的光合色素含量產(chǎn)生負面影響[27]。在本研究中,兩種觀賞草葉片的類胡蘿卜素含量隨著O3濃度的升高均沒有明顯的變化,這與類胡蘿卜素在葉綠體中除了傳遞光合能量外,還能保護受光激發(fā)的葉綠體免受氧化作用破壞,在一定程度上保護光合膜,使光合作用在受到脅迫時仍能順利進行等有關[28]。在高濃度O3脅迫下,白穗狼尾草的葉綠素含量比拂子茅下降得快,表明白穗狼尾草對O3升高比較敏感,而清除活性氧ROS的能力較弱。植物葉片大量ROS的積累,對葉綠素造成氧化破壞,引起葉綠素的合成減少,降解速度加快[29]；在逆境脅迫初期,拂子茅表現(xiàn)出較強的抗氧化能力,能在一定程度上保護葉綠體結構不被破壞,這與陶漢成等[30]對紫丁香葉片的研究結果相一致。

光合作用是綠色植物獲取物質(zhì)和能量的最基本來源,植物凈光合速率是衡量植物生產(chǎn)力的指標之一。大量研究表明,O3濃度升高會降低植物的凈光合效率。例如Yu等[31]的研究發(fā)現(xiàn),在O3濃度為150 nmol/mol的脅迫下閩楠(Phoebebournei)、刨花潤楠(Machiluspauhoi)和紅豆杉(Taxuschinensis)的葉片Pn顯著下降；王義婧等[32]對美國薄荷(Monardadidyma)的研究也發(fā)現(xiàn),O3濃度在120 nmol/mol下處理7 d時,薄荷葉片Pn開始顯著下降。本研究結果也表明,在O3濃度為160 nmol/mol的脅迫下兩種觀賞草葉片Pn顯著降低。植物葉片內(nèi)的O3滯留不僅引起凈光合效率下降,還會誘導葉片氣孔關閉及阻力增加[33]。本研究結果表明,兩種觀賞草葉氣孔導度隨著O3濃度的升高呈下降趨勢。高濃度O3能夠刺激氣孔關閉從而避免更多的O3進入葉片內(nèi)部,這是植物對逆境脅迫的應激響應[34- 35]。同時,氣孔導度降低也使得植物體本身得不到足夠的光合原料供應,Rubisco活性受損導致葉片內(nèi)部CO2積累,導致光合作用減弱[36- 37]。

3.2 高濃度O3脅迫對兩種園林觀賞草葉片氧化傷害、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活的影響

高濃度O3脅迫不僅破壞植物的光合色素,抑制光合作用,還誘發(fā)植物細胞內(nèi)活性氧濃度增加而導致氧化脅迫[38]。MDA是植物抵抗逆境膜脂過氧化的產(chǎn)物,是衡量植物細胞膜脂過氧化程度大小最常用的指標[13]；本研究表明,白穗狼尾草在高濃度O3處理下MDA含量顯著增加,這與秦子晴等[15]對醉蝶花(Cleomespinosa)以及Antonella等[39]對石榴(Punicagranatum)的研究結果一致。這表明長時間的高濃度O3熏蒸誘發(fā)了植物葉片體內(nèi)活性氧的累積,加速了其膜脂過氧化作用,導致膜結構破壞,透性增大。本研究表明,拂子茅MDA含量隨O3濃度增加呈緩慢上升趨勢,但較對照組無顯著變化。Xu等[40]的研究結果也表明高濃度O3脅迫下,銀杏(Ginkgobiloba)和華山松(Pinusarmandii)葉的MDA含量較對照組均沒有顯著增加。MDA含量的不顯著變化表明了植物具有較強的抗氧化能力,對臭氧脅迫具有一定的耐受性。

研究表明,O3脅迫下大部分植物可溶性蛋白含量呈下降趨勢[28]。本研究結果與前人一致[41],兩種觀賞草隨O3濃度的升高可溶性蛋白含量較對照均呈顯著下降趨勢,導致植物可溶性蛋白含量下降的原因主要分別為兩方面：一是O3進入植物細胞后促進了蛋白水解酶的活性,加強了原有蛋白質(zhì)分解,從而使蛋白質(zhì)含量下降；二是O3對蛋白合成的眾多酶系均有毒害和氧化作用,并且會使蛋白質(zhì)合成的相關細胞器如細胞核核仁等受到損傷,抑制了新蛋白的合成[41]。

3.3 兩種園林觀賞草對高濃度O3脅迫的主成分分析

植物對逆境環(huán)境的適應程度由多個生理生化指標共同決定,由于各指標間的相關性,統(tǒng)計數(shù)據(jù)所反映的信息具有重疊性[45]。主成分分析主要將多指標轉化為數(shù)個主成分,其中每個主成分能夠攜帶大部分原始變量信息,且不重復[23]。張志偉[46]選取相對電導率、葉片含水量、POD、MDA、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)、游離脯氨酸(Pro)等7個生理指標對5種棕櫚科苗木的抗寒性進行主成分分析,結果表明布迪椰子(Butiacapitata)抵御低溫能力最強,美麗針葵(Phoenixroebelenii)抵御低溫能力最弱；Yan等[47]對蘋果砧木的抗寒性選取可溶性淀粉、花青素、SS、SP、Pro、SOD、POD、MDA等指標進行主成分分析,篩選出抗寒能力最強的砧木,綜合評價后的結果與其觀察結果一致。本研究中主成分綜合得分顯示,兩種觀賞草對大氣O3脅迫的耐受能力表現(xiàn)為拂子茅高于白穗狼尾草,這與試驗中測定的主要生理生化指標變化規(guī)律中反映出的結果相一致,表明基于主成分分析法對葉綠素含量等8個指標綜合評價植物抗性結果是可靠的,主成分分析可以適用于觀賞草的耐O3能力的綜合評價。

4 結論

在不同高濃度O3脅迫下,兩種觀賞草均受到了不同程度的影響,其生理響應特征基本一致,但也存在一定種間差異?；谏硖卣鞅容^及主成成分分析表明,拂子茅的耐O3能力強于白穗狼尾草,原因在于拂子茅在臭氧脅迫初期具有較強的抗氧化能力及適應臭氧的氣孔調(diào)節(jié)能力,從而減緩了O3對其的氧化脅迫及傷害。因此,在臭氧高污染地區(qū)拂子茅會具有更高的應用潛力。