褚亞慧 孔維佳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒室，北京 100050

天麻素（gastrodin，GAS）是中藥天麻的主要有效成分之一，可由天麻的根莖中提取或化學(xué)合成獲得。研究發(fā)現(xiàn)除了治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，GAS 還具有其他多種藥理作用[1-4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，GAS 用于四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎損害模型具有降尿酸（uric acid，UA）作用[5]，但其機(jī)制尚不明確。高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）可導(dǎo)致痛風(fēng)和腎功能損害，并與一些代謝性疾病和循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以次黃嘌呤誘導(dǎo)小鼠的急性HUA，并研究了GAS 的降UA 作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品和試劑

GAS 購自上海麥克林生化科技有限公司（批號(hào)：C10915097），別嘌呤醇（allopurinol，ALLO）、次黃嘌呤和羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma 公司，血清生化指標(biāo)檢測試劑盒購自北京中生北控生物科技有限公司。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究有限公司。QIAsymphony RNA Kit 購自德國QIAGEN 公司，GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和GoTaq?qPCR Master Mix 試劑盒購自美國promega 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明種小鼠50 只，體重18～20 g，購自北京康藍(lán)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0011。所有動(dòng)物于SPF 級動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，自由飲水，投喂常規(guī)嚙齒類顆粒飼料。

1.1.3 儀器

7100 型全自動(dòng)生化分析儀購自QIAGEN 公司，NanoDrop 2000 型超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，ABI 7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案由醫(yī)藥生物技術(shù)研究所倫理委員會(huì)審核通過，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作和流程遵循中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教學(xué)用動(dòng)物使用指南》[8]。動(dòng)物隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、GAS 200 mg/kg組、GAS 400 mg/kg 組和ALLO 10 mg/kg 組。正常組和模型組每日灌胃同等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，其余各組每日灌胃給藥。藥物于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中溶解，灌胃體積為0.3 ml/只，持續(xù)14 d。

第13 天晚上8∶00 所有動(dòng)物禁食，第二天上午8∶00 最后一次灌胃給藥。給藥1 h 后除正常組外其余各組動(dòng)物腹腔（intraperitoneal，i.p.）注射次黃嘌呤1000 mg/kg[9]。次黃嘌呤溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，注射體積為0.2 ml/只。注射45 min 后[9]所有動(dòng)物眼眶取血置于離心管中，二氧化碳麻醉處死后取肝臟和腎臟置液氮中快速冷凍，然后于-80℃冰箱中凍存。

血標(biāo)本于室溫靜置2 h 后以3000 rpm（r=7 cm）離心10 min 分離血清。每個(gè)血清標(biāo)本取0.2 ml，分別用相應(yīng)試劑盒并參考說明書在全自動(dòng)生化分析儀上測定UA、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）等生化指標(biāo)。

1.2.2 肝臟XOD 活力測定

每只小鼠稱取約0.2 g 肝組織，以0.9%生理鹽水按重量體積比1∶9 制成10%勻漿液。于3000 r/min，半徑7 cm 離心10 min，然后取上清按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。反應(yīng)結(jié)束后以分光光度計(jì)測量530 nm 的吸光度，結(jié)果以U/g 肝組織表示。

1.2.3 組織RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以試劑盒提取腎組織總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系、溫度和時(shí)間等條件參考文獻(xiàn)報(bào)道[10]，反應(yīng)結(jié)束后樣品置-20℃凍存。定量PCR 的基因特異性引物見表1，PCR 反應(yīng)體系、條件和循環(huán)數(shù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[10]。反應(yīng)結(jié)束后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參對目的基因包括尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（urate transporter 1，URAT1） 和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）（表1）進(jìn)行校正，并以文獻(xiàn)報(bào)道[10]的方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平，結(jié)果以正常組的倍數(shù)表示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 小鼠引物（5′-3′）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GAS 減輕次黃嘌呤誘導(dǎo)的小鼠急性HUA

模型組小鼠血清UA 水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）。作為陽性對照藥，劑量為10 mg/kg 的ALLO 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降（與模型組比較，P＜0.001），與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組的BUN、Scr、ALT 和AST 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標(biāo)的影響（±s）

表2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標(biāo)的影響（±s）

與正常組比較，aaaP＜0.001，與模型組比較，bP＜0.05、bbP＜0.01、bbbP＜0.001

組別UA（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）正常組（n=10）模型組（n=10）GAS 200 mg/kg 組（n=10）GAS 400 mg/kg 組（n=10）ALLO 10 mg/kg 組（n=10）163.5±21.1 620.8±124.4aaa 504.4±47.6b 373.8±43.1bb 140.5±28.1bbb 6.77±0.72 6.99±0.74 6.43±0.58 6.91±0.70 6.76±0.33 52.20±4.83 56.83±6.93 54.05±4.87 54.81±5.19 56.80±8.46 34.82±4.93 33.09±5.20 32.50±5.39 33.57±4.17 35.33±3.80 131.7±15.9 136.2±16.9 128.3±13.2 133.0±14.1 138.4±19.9

2.2 GAS 抑制小鼠肝臟XOD 活力

模型組小鼠肝臟XOD 活力高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS使小鼠肝臟XOD 活力下降（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）。ALLO 使小鼠肝臟XOD 活力下降（與模型組比較，P＜0.01），與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

與正常組比較，aaP＜0.01；與模型組比較較，bP＜0.05、bbP＜0.01

2.3 GAS 下調(diào)小鼠腎臟URAT1 而上調(diào)OAT1 的mRNA 表達(dá)

模型組小鼠腎臟URAT1 的mRNA 表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2A），而OAT1的mRNA 表達(dá)水平低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2B）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 使小鼠腎臟URAT1 的mRNA 水平減少（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）（圖2A），同時(shí)使OAT1 的mRNA水平增加（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）（圖2B）。ALLO 使小鼠腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達(dá)水平恢復(fù)（與模型組比較，P＜0.01），與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠腎臟URAT1（A）和OAT1（B）mRNA 表達(dá)水平的影響（n=10，±s）

3 討論

本研究探討了GAS 對小鼠急性HUA 的作用，并報(bào)道了GAS 降UA 的可能機(jī)制。次黃嘌呤是UA 生物合成的前體物質(zhì)之一[11]，本實(shí)驗(yàn)通過i.p.注射次黃嘌呤成功復(fù)制了小鼠急性HUA 模型，并發(fā)現(xiàn)劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥具有明顯的降UA 作用，能有效減輕小鼠HUA。該結(jié)果與近期Ma等[5]的研究結(jié)果相一致，提示GAS 對不同因素誘導(dǎo)的小鼠血清UA 升高均具有抑制作用。

XOD 主要分布于肝臟和腸道等組織，是UA 合成的關(guān)鍵酶，也是ALLO 等降UA 藥物的主要作用靶點(diǎn)之一[11]。本研究結(jié)果顯示，GAS 使小鼠肝臟XOD的活力下降，提示GAS 能抑制肝臟中UA 的合成。另有研究發(fā)現(xiàn)，在體外無細(xì)胞的反應(yīng)體系中，濃度低至0.1 μmol/L 的GAS 即能有效抑制XOD 的催化活性，使UA 的產(chǎn)生量明顯減少[12]。本文的結(jié)果與之符合，并進(jìn)一步證明了GAS 在體內(nèi)對XOD 活力的抑制作用。

URAT1 和OAT1 分別參與腎小管對UA 的重吸收和分泌，在維持體內(nèi)尿酸代謝平衡方面發(fā)揮重要作用[13-14]。目前，URAT1 抑制劑是降尿酸和抗痛風(fēng)藥物的研發(fā)熱點(diǎn)，并且已有多個(gè)候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[15-16]。本研究結(jié)果顯示，小鼠i.p.注射次黃嘌呤后腎組織URAT1 的mRNA 表達(dá)升高而OAT1 的mRNA表達(dá)下降，提示腎臟對UA 的重吸收增加而分泌減少。GAS 灌胃給藥后明顯下調(diào)URAT1 的mRNA 表達(dá)同時(shí)上調(diào)OAT1 的mRNA 表達(dá)，說明GAS 能抑制腎臟對UA 的重吸收并增加其分泌，從而促進(jìn)UA 從體內(nèi)排泄。

目前臨床常用的降尿酸藥物有ALLO、非布司他、苯溴馬隆、丙磺舒等。這些藥物通常有較多不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)、藥物性肝炎、消化道反應(yīng)、血象異常等，并不適合長期應(yīng)用[17-19]。臨床上口服GAS 不良反應(yīng)輕微且多呈一過性，大多無需停藥或特殊處理，且未見報(bào)道有肝腎功能損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)[20-21]。GAS的良好安全性為其進(jìn)一步研發(fā)用于新的臨床適應(yīng)證奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，GAS 灌胃用于次黃嘌呤誘導(dǎo)的小鼠急性HUA 能有效降低血清UA 濃度，其機(jī)制可能與抑制肝臟XOD 活力以及調(diào)控腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達(dá)有關(guān)，具有一定的開發(fā)和應(yīng)用前景。