李 兵

隨著人們生活水平的提高、膳食結(jié)構(gòu)的改變及人口老齡化的加劇，我國(guó)心血管疾病致死率居致死疾病首位，也是我國(guó)居民猝死的主要誘因之一[1]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)過(guò)剩所致氧化應(yīng)激損傷及ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與各種心血管疾病進(jìn)展密切相關(guān)[2]，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死及治療實(shí)現(xiàn)再灌注后引起ROS大量產(chǎn)生過(guò)剩[3]。因此，尋找能降低氧化應(yīng)激損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡的新型藥物成為目前治療研究的熱點(diǎn)。

丹參多酚酸鹽(salvianolate，SAL)是中藥丹參的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性[4]，臨床主要用于輕度、中度穩(wěn)定型心絞痛的治療。過(guò)氧化物酶體增殖子活化受體(PPARγ)/核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗血紅素加氧酶-1(HO-1)通路在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5-6]。本研究以H9c2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討SAL對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響及PPARγ/Nrf2/HO-1通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將H9c2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次，取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 SAL購(gòu)自上海綠谷制藥有限公司[規(guī)格：每瓶50 mg(含丹參乙酸鎂40 mg)，批號(hào)1903027]；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青鏈霉素、DMSO、四唑鹽(MTT)試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；2，7-雙乙酸二氯熒光(DCFH-DA)探針購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗鼠PPARγ、Nrf2、HO-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體購(gòu)自購(gòu)自Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗、ROS試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 HERACell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Thermo公司)；Synergy Mx型多功能熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；ST16R型超速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀、PowerPac HV型電泳儀、Trans-Blot SD型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；C600型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Azure公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型制備與分組 細(xì)胞模型制備[7]：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2心肌細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，更換含有100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h以制備H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷模型，設(shè)置H2O2組、SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組；另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2心肌細(xì)胞作為正常組。

1.4.2 細(xì)胞增殖率檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組分別加入含50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加入常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔10 μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后消化并收集細(xì)胞，之后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度(A)，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A藥物組/A正常組)×100%。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組分別加入含50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加入常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后消化，2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明，滴加稀釋后的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4.4 細(xì)胞ROS含量檢測(cè) 取濃度1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于黑底不透明的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組分別加入含終濃度50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液和終濃度10 μmol/L的DCFH-DA培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加入含終濃度10 μmol/L的DCFH-DA常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，之后通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)；通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度反映ROS含量。

1.4.5 CK-MB、LDH漏出量和MDA含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè) 參照1.4.3中方法分組和給藥干預(yù)后，取各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)生化分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞CK-MB、LDH漏出量。棄培養(yǎng)液，胰酶消化并以2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、3 500 r/min離心10 min取上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法分別檢測(cè)SOD、CAT活性。

1.4.6 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照1.4.3中方法分組和給藥干預(yù)后，消化并收集細(xì)胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度后沸水浴5 min，使蛋白完全變性，以30 μg蛋白量上樣進(jìn)行5%濃縮膠(60 V電壓)和10%分離膠(100 V電壓)電泳分離，半干法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置PVDF膜于5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別滴加稀釋后的目標(biāo)蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜3次后滴加山羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗膜3次后滴加ECL溶液，暗盒中顯影后采用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 SAL對(duì)H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞增殖率和凋亡率的影響 與正常組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.01)；與H2O2組比較，SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組H9c2心肌細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、圖2。

圖1 SAL對(duì)H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖(A為正常組；B為H2O2組；C為SAL 50 mg/L組；D為SAL 100 mg/L組；E為SAL 200 mg/L組)

與正常組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖2 各組H9c2心肌細(xì)胞增殖率和凋亡率比較(A為細(xì)胞增殖率；B為細(xì)胞凋亡率)

2.2 各組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量比較 與正常組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量升高(P<0.01)；與H2O2組比較，SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3、圖4。

圖3 SAL對(duì)H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞ROC含量的熒光強(qiáng)度

與正常組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，△P<0.01。 圖4 各組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量比較

2.3 各組H9c2心肌細(xì)胞CK-MB、LDH漏出量比較 與正常組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞CK-MB、LDH漏出量升高(P<0.01)；與H2O2組比較，SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組H9c2心肌細(xì)胞CK-MB、LDH漏出量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖5。

與正常組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖5 各組H9c2心肌細(xì)胞CK-MB、LDH漏出量比較(A為CK-MB；B為L(zhǎng)DH)

2.4 各組H9c2心肌細(xì)胞MDA含量和SOD、CAT活性比較 與正常組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞MDA含量升高，SOD、CAT活性降低(P<0.01)；與H2O2組比較，SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組H9c2心肌細(xì)胞MDA含量降低，SOD、CAT活性升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖6。

與正常組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖6 各組H9c2心肌細(xì)胞MDA含量和SOD、CAT活性比較(A為MDA含量；B為SOD活性；C為CAT活性)

2.5 各組H9c2心肌細(xì)胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞PPARγ、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)下調(diào)，NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)(P均<0.01)；與H2O2組比較，SAL 50 mg/L組、SAL 100 mg/L組、SAL 200 mg/L組H9c2心肌細(xì)胞PPARγ、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖7、圖8。

圖7 各組H9c2心肌細(xì)胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖(A為正常組；B為H2O2組；C為SAL 50 mg/L組；D為SAL 100 mg/L組；E為SAL 200 mg/L組)

與正常組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖8 各組H9c2心肌細(xì)胞PPARγ、Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

H2O2是細(xì)胞生理代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物，參與基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、細(xì)胞增殖等過(guò)程，但過(guò)量的H2O2將誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS大量生成，過(guò)度消耗以ROS為底物的抗氧化酶(SOD、CAT)，引起ROS過(guò)剩蓄積導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞蛋白、核酸、DNA等大分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；ROS可攻擊生物膜中不飽和脂肪酸導(dǎo)致的過(guò)氧化損傷，具有生物毒性的MDA是過(guò)氧化終產(chǎn)物之一，且細(xì)胞膜損傷后細(xì)胞內(nèi)CK-MB、LDH將漏出，因此，ROS、CK-MB、LDH、MDA含量及SOD、CAT活性可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度[9]。

SAL是丹參的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性[4]。本研究通過(guò)H2O2干預(yù)制備H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，給予不同濃度的SAL進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，經(jīng)SAL干預(yù)能顯著提高H9c2心肌細(xì)胞增殖率，降低細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞ROS、MDA含量和CK-MB、LDH漏出量，提高SOD、CAT活性，提示SAL對(duì)H2O2所致H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。Nrf2是體內(nèi)細(xì)胞普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用[10]。Deshmukh等[11]研究顯示，ROS能誘導(dǎo)Nrf2與抑制劑Keap1解離而活化，移核轉(zhuǎn)位并激活抗氧化反應(yīng)元件，促進(jìn)抗氧化酶(SOD、CAT等)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。HO-1是Nrf2下游基因，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2被激活進(jìn)入核后將啟動(dòng)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)而催化降解血紅素、一氧化碳等，抑制氧化應(yīng)激損傷[12]。NF-κB能促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)與活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]；Huang等[14]研究顯示，HO-1能抑制NF-κB啟動(dòng)子核轉(zhuǎn)錄因子κB激酶抑制劑(IKK)β磷酸化從而抑制NF-κB活化。PPARγ對(duì)葡萄糖、脂質(zhì)代謝等具有重要的調(diào)節(jié)作用，Hang等[15]研究顯示，PPARγ與Nrf2啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)Nrf2表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SAL干預(yù)能上調(diào)PPARγ、Nrf2、HO-1表達(dá)并下調(diào)NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)。

綜上所述，SAL對(duì)H2O2所致H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活PPARγ/Nrf2/HO-1通路有關(guān)。