宋亞娟，馬景紅，陳勝強(qiáng)，李守霞，何曉麗，王銀龍，張 冰，單鐵英，高立威

阿爾茨海默病(AD)在年齡>65歲的人群發(fā)生率較高，病人常表現(xiàn)為認(rèn)知障礙及行為異常，多由中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能漸進(jìn)性衰退所致，特異性病理改變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞外間質(zhì)存在異常表達(dá)的β-淀粉樣蛋白(Aβ)堆積[1-3]。相關(guān)研究顯示，AD病人腦組織Aβ多數(shù)透過血腦屏障從血液轉(zhuǎn)運而來的[4-5]。腦部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和相鄰細(xì)胞膜之間的緊密連接結(jié)構(gòu)構(gòu)成了血腦屏障的主要成分，這些成分的活性和含量變化直接影響血腦屏障的功能。本研究體外培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(BMECs)，觀察β-淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)對細(xì)胞活力及細(xì)胞膜咬合蛋白、緊密連接蛋白-1表達(dá)的影響，經(jīng)黃芪提取物干預(yù)后分析上述指標(biāo)改變，探討黃芪提取物對血腦屏障的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及實驗試劑 小鼠BMECs由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供；Aβ1-40由北京方程生物提供，先溶于蒸餾水中稀釋為10 g/L，放入恒溫箱1周，滅菌后冷藏。黃芪提取物由恒瑞康生物科技有限公司提供，滴加少量的無水乙醇震搖，再使用適量的蒸餾水配制濃度，滅菌后冷藏。噻唑藍(lán)由上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司提供，咬合蛋白及緊密連接蛋白1的第一抗體由菲恩生物科技有限公司提供。Trizol試劑、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將BMECs接種到底部鋪有明膠的中等培養(yǎng)瓶里，使用培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞特有的孵育液，放入常規(guī)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h更換1次細(xì)胞孵育液，待細(xì)胞幾乎全部鋪滿瓶底時用于實驗。細(xì)胞從瓶底部消化，制成單個細(xì)胞的懸液，將含1×104的細(xì)胞懸液滴加在設(shè)有6個培養(yǎng)孔的塑料板里，分為對照組、Aβ誘導(dǎo)組及黃芪提取物組。對照組：加入培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液；Aβ誘導(dǎo)組：在對照組基礎(chǔ)上加入5 μmol/L Aβ1-40；黃芪提取物組：在Aβ誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上分別加入25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL黃芪提取物。

1.2.2 噻唑藍(lán)比色法觀察細(xì)胞活力 將正常的細(xì)胞分別消化并制成含1×104的細(xì)胞懸液，滴加在設(shè)有96個培養(yǎng)孔的塑料板里，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后使細(xì)胞生長同步化，按照1.2.1所述分為3組，每組設(shè)置6個重復(fù)培養(yǎng)孔，培養(yǎng)1 d、2 d、3 d后每孔去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，依次滴入1 mg/mL的噻唑藍(lán)溶液100 μL，在無光線的培養(yǎng)箱里作用4 h，吸干凈每孔上清液，依次滴加適量的二甲基亞砜溶液，輕搖10 min，使底部結(jié)晶物質(zhì)被完全溶解，啟動酶聯(lián)免疫檢測儀，調(diào)節(jié)波長為490 nm，將細(xì)胞板置入儀器中，讀取每孔吸光度值，分析5組細(xì)胞活力。

1.2.3 蛋白印跡法測定細(xì)胞咬合蛋白和緊密連接蛋白1 蛋白含量 使用含有6個培養(yǎng)孔的塑料板，將細(xì)胞分為對照組、Aβ誘導(dǎo)組和100 μg/mL黃芪提取物組。待細(xì)胞生長48 h后，在各孔內(nèi)加入適量的用于裂解培養(yǎng)細(xì)胞的溶液，低溫下采用超聲將細(xì)胞打碎，置于低溫超速離心機(jī)中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速13 000 r/min，時間 10 min，結(jié)束時留取懸液檢測其中蛋白質(zhì)含量，同時向其內(nèi)滴入2倍的十二烷基磺酸鈉溶液，沸水方法使蛋白熱變性，取少許蛋白加入凝膠孔中在穩(wěn)定電壓下進(jìn)行電泳分離蛋白，之后將膠中分離蛋白條帶采用電轉(zhuǎn)移方式移入硝酸纖維膜中，常溫下膜浸入封閉液中 1 h，浸入適當(dāng)比例稀釋的一抗(咬合蛋白和緊密連接蛋白1)溶液4 h，清洗膜數(shù)次后浸入二抗溶液，清洗膜數(shù)次后滴加發(fā)光試劑讓其顯影。含有蛋白的部位顯示為不同灰度的短條影，分析灰度值評定蛋白含量。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析細(xì)胞咬合蛋白及緊密連接蛋白1 mRNA表達(dá) 按照1.2.3進(jìn)行細(xì)胞分組并孵育48 h后，加入Trizol提取3組細(xì)胞總RNA，將mRNA作為模板，遵循RNA逆轉(zhuǎn)錄流程依次操作，最后將獲取的反應(yīng)液滴加到實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)體系中，根據(jù)說明書依次操作，每組6個重復(fù)孔。按照說明書設(shè)置反應(yīng)條件，共40個循環(huán)；獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物采用2-△△CT計算兩種蛋白mRNA相對值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 培養(yǎng)第1天，5個不同處理組細(xì)胞吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)過第2天、第3天培養(yǎng)，與對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組吸光度值隨著孵育天數(shù)增加逐漸減小(P<0.05)；與Aβ誘導(dǎo)組比較，黃芪提取物組吸光度值隨著黃芪提取物劑量增加和培養(yǎng)時間延長而增大(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較(±s)

2.2 3組細(xì)胞咬合蛋白和緊密連接蛋白1蛋白含量比較 3個不同處理組細(xì)胞孵育次日，與對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組咬合蛋白和緊密連接蛋白1相對值減小(P<0.05)；與Aβ誘導(dǎo)組比較，100 μg/mL黃芪提取物組咬合蛋白和緊密連接蛋白1相對值增大(P<0.05)。詳見圖1、表2。

對照組 Aβ誘導(dǎo)組 100 μg/mL黃芪 提取物組

表2 3組咬合蛋白及緊密連接蛋白1蛋白表達(dá)比較(±s)

2.3 3組咬合蛋白mRNA和緊密連接蛋白1 mRNA表達(dá)比較 3個不同處理組細(xì)胞孵育2 d，與對照組比較，Aβ誘導(dǎo)組咬合蛋白mRNA和緊密連接蛋白1 mRNA表達(dá)減小(P<0.05)；與Aβ誘導(dǎo)組比較，100 μg/mL黃芪提取物組咬合蛋白mRNA和緊密連接蛋白1 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組細(xì)胞咬合蛋白mRNA和緊密連接蛋白1 mRNA比較(±s)

3 討 論

導(dǎo)致AD發(fā)生的因素較多，這些因素的作用機(jī)制尚不明確。已明確的是AD病變神經(jīng)組織內(nèi)含有由大量Aβ堆積斑塊、神經(jīng)元胞質(zhì)中神經(jīng)纖維纏結(jié)，且腦部部分區(qū)域較多神經(jīng)細(xì)胞不存在或缺失[6-7]。關(guān)于AD病因及機(jī)制，公認(rèn)的是Aβ在神經(jīng)組織大量存在并造成一系列的病理反應(yīng)，最終導(dǎo)致發(fā)病區(qū)域較多神經(jīng)細(xì)胞損傷或缺失[8-9]，因此，Aβ大量存在于神經(jīng)組織是AD的始動因素。Aβ是前體蛋白(廣泛存在于機(jī)體的多種細(xì)胞里)，在相關(guān)酶分解作用下的產(chǎn)物，可溶性產(chǎn)物之一Aβ1-40較易黏附于神經(jīng)組織血管壁上，造成血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)損傷[10]。已有研究顯示，AD神經(jīng)組織中Aβ多數(shù)是透過血腦屏障從血液轉(zhuǎn)運而來的[4-5]。神經(jīng)組織血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞和相鄰細(xì)胞膜之間的緊密連接結(jié)構(gòu)是組成血腦屏障的關(guān)鍵要素，其改變直接影響血腦屏障功能[11-13]。

血腦屏障是腦組織的血管內(nèi)血液與血管外組織存在的一種結(jié)構(gòu)性屏障，其結(jié)構(gòu)中內(nèi)皮細(xì)胞及相鄰內(nèi)皮細(xì)胞膜上的緊密連接是主要的結(jié)構(gòu)和功能成分，緊密連接結(jié)構(gòu)主要由內(nèi)皮細(xì)胞膜上咬合蛋白和胞質(zhì)內(nèi)的緊密連接蛋白構(gòu)成，兩者在緊密連接結(jié)構(gòu)功能上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，決定著血腦屏障通透性的嚴(yán)密性[12，14-15]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，AD發(fā)病早期已出現(xiàn)腦組織血管功能下降，構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含量減少，對AD的發(fā)展起著促進(jìn)作用[16-18]。

本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，經(jīng)Aβ1-40孵育的腦組織血管內(nèi)皮細(xì)胞活性下降，內(nèi)皮細(xì)胞膜上咬合蛋白及細(xì)胞質(zhì)中緊密連接蛋白1蛋白和mRNA含量減少；采用黃芪提取物干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞活性增加，內(nèi)皮細(xì)胞膜上咬合蛋白及緊密連接蛋白1蛋白和mRNA含量增多。結(jié)果提示，黃芪提取物通過提高Aβ1-40損傷的內(nèi)皮細(xì)胞活性，并恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞膜上咬合蛋白及胞質(zhì)中緊密連接蛋白1蛋白和mRNA表達(dá)維持血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性。關(guān)于其作用的細(xì)胞內(nèi)分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。