劉蘭椿，劉 超，毛啟遠(yuǎn)，王 階

化療是治療腫瘤的常用手段，但臨床化療藥物存在較大的毒副作用，其中以嚴(yán)重的心臟毒性常見，若病變發(fā)生在心肌，病人預(yù)后極差，死亡率達(dá)48%[1]。化療后出現(xiàn)的心臟毒性臨床表現(xiàn)多樣，輕者無(wú)癥狀，僅出現(xiàn)缺血性心電圖改變，重者發(fā)生心肌壞死、致死性充血性心力衰竭[2]。現(xiàn)階段常用的化療藥物中引起心肌損傷的有柔紅霉素、阿霉素及表阿霉素等，但關(guān)于化療藥物造成的心肌損傷機(jī)制尚不明確，雖有氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、鈣超載及能量代謝障礙學(xué)說(shuō)，但針對(duì)兩種假說(shuō)研發(fā)的西藥右丙亞胺、磷酸肌酸等存在對(duì)化療病人的總體無(wú)進(jìn)展生存期影響不大、遠(yuǎn)期生存率無(wú)明顯差異的問(wèn)題[3-4]，導(dǎo)致臨床許多惡性腫瘤病人最終死于嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，而非腫瘤本身，故發(fā)生機(jī)制與防治手段是目前心血管專家與腫瘤專家共同面臨的難題。

化療藥物的副作用屬于藥毒范疇，從中醫(yī)學(xué)分析，藥毒是強(qiáng)烈的致病因素，藥毒致病最易傷人正氣，病情復(fù)雜而兇險(xiǎn)，病程漫長(zhǎng)且頑固難治[5]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是補(bǔ)氣生血的經(jīng)典名方，始載于《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1組成。方中重用黃芪益氣托毒，為君藥；當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有補(bǔ)氣養(yǎng)血托毒之功效，臨床應(yīng)用以氣血虛弱、陽(yáng)氣浮越、脈洪大而虛、重按無(wú)力為辨證要點(diǎn)，有研究顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有保護(hù)缺血心肌、促進(jìn)血管生成等作用[6]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，恢復(fù)化療引起的免疫功能低下[7]。盡管藥理學(xué)證明當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有抗腫瘤和保護(hù)心血管的作用，但具體機(jī)制尚不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療化療所致心肌損傷的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 篩選有效成分及靶基因 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)[8]得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯中“當(dāng)歸”“黃芪”的“ingredients”活性成分，之后基于文獻(xiàn)報(bào)道納入生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.05的有效成分，此時(shí)貼近當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)的藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特征[9]。最終納入“related targets”中相應(yīng)靶點(diǎn)，并根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)查詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 獲取當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的靶基因 在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD)、藥物數(shù)據(jù)庫(kù)(DrugBank)中檢索心肌損傷的關(guān)鍵詞“myocardial injury”，下載疾病基因文件，之后將當(dāng)歸、黃芪靶基因分別與疾病基因進(jìn)行映射，與疾病基因取并集，得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯組方干預(yù)心肌損傷的可能靶基因，并繪制Venn圖。

1.3 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 將當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的靶基因與OB≥30%和DL≥0.05篩選出的當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分映射，創(chuàng)建包含“疾病-靶點(diǎn)”“藥物-靶點(diǎn)”“藥物-成分”的“network”文件及描述節(jié)點(diǎn)類型的“type”文件，將兩個(gè)文件導(dǎo)入CytoScape 3.7.2軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)-疾病交互網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)(node)代表當(dāng)歸、黃芪活性成分、關(guān)鍵靶基因及心肌損傷疾??；邊(edge)代表上述節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò) 利用STRING整合預(yù)測(cè)PPI，可視化展示PPI網(wǎng)絡(luò)功能[10]。選擇“multiple proteins”輸入關(guān)鍵靶基因，對(duì)“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，選擇高等置信度為0.950，下載PPI關(guān)系圖及tsv文件，并篩選居前30位核心基因。

1.5 靶基因基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 在R軟件(Version 3.6.1)安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運(yùn)行，將當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)換成entrezID。之后在R軟件安裝“clusterProfiler”和“DOSE”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05進(jìn)行關(guān)鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分及靶基因 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索當(dāng)歸、黃芪兩味藥的所有有效成分(截至2020年1月)，結(jié)果顯示當(dāng)歸活性成分共125個(gè)、黃芪活性成分共87個(gè)。根據(jù)OB≥30%和DL≥0.05篩選出當(dāng)歸活性成分27個(gè)、黃芪活性成分32個(gè)，共59個(gè)活性成分。選擇“related targets”獲得當(dāng)歸靶點(diǎn)272個(gè)、黃芪靶點(diǎn)435個(gè)，藥物靶點(diǎn)共707個(gè)。

2.2 治療心肌損傷的相關(guān)基因 通過(guò)GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank獲得2 943個(gè)心肌損傷相關(guān)基因，與272個(gè)當(dāng)歸、435個(gè)黃芪的靶基因去重后進(jìn)行映射，共得到157個(gè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的靶基因(與綠色相交部分)，其中得到黃芪治療心肌損傷的可能靶基因154個(gè)，當(dāng)歸治療心肌損傷的可能靶基因40個(gè)。詳見圖1。

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷相關(guān)靶基因Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將157個(gè)心肌損傷治療相關(guān)靶基因分別與27個(gè)當(dāng)歸活性成分、32個(gè)黃芪活性成分進(jìn)行映射，建立當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分與靶基因的聯(lián)系，同時(shí)得到治療心肌損傷的24個(gè)當(dāng)歸成分、23個(gè)黃芪成分，共涉及有效成分47個(gè)，詳見表1。將包含“疾病-靶點(diǎn)”“藥物-靶點(diǎn)”“藥物-成分”的“network”文件和描述節(jié)點(diǎn)類型的“type”文件導(dǎo)入到CytoScape 3.7.2中，建立“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，紫色三角代表當(dāng)歸的24個(gè)有效成分，紅色箭頭代表黃芪的23個(gè)有效成分，黃色橢圓代表154個(gè)相關(guān)靶基因。詳見圖2。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的活性成分及OB、DL

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)(紫色三角代表當(dāng)歸有效成分，紅色箭頭代表黃芪有效成分，黃色橢圓代表靶基因)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將關(guān)鍵靶基因輸入到STRING中，選擇高等置信度0.950，下載PPI及tsv文件，得到109個(gè)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)R語(yǔ)言的計(jì)算結(jié)果，其中轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(Akt1)、白細(xì)胞介素6(IL6)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65亞基(RELA)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)居前5位。詳見圖3、圖4。

圖3 PPI核心基因

圖4 中藥-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)(degree值，居前30位)

2.5 關(guān)鍵靶基因GO功能富集 通過(guò)關(guān)鍵靶基因，共富集124個(gè)生物學(xué)過(guò)程和功能，根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，選擇前30個(gè)進(jìn)行條形圖展示，詳見圖5。當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分主要參與腎上腺素受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、兒茶酚胺結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、磷酸酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、血紅素結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心肌損傷的治療作用。

圖5 關(guān)鍵靶基因GO功能富集分析

2.6 關(guān)鍵靶基因KEGG功能富集 對(duì)關(guān)鍵靶基因與KEGG進(jìn)行映射，共富集163條通路，根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，選擇前30個(gè)進(jìn)行氣泡圖展示，詳見圖6。當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分主要參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK、白細(xì)胞介素17、腫瘤壞死因子(TNF)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)等相關(guān)信號(hào)通路。其中PI3K/Akt信號(hào)通路作為自噬關(guān)鍵通路在心肌損傷中起到重要作用。

圖6 關(guān)鍵靶基因KEGG功能富集分析

3 討 論

化療易對(duì)心肌造成損傷，藥毒傷陰耗氣，導(dǎo)致心氣虛，出現(xiàn)乏力、呼吸困難等癥狀。心臟的正常搏動(dòng)主要依賴于心氣。心氣作為實(shí)現(xiàn)心臟功能的推動(dòng)力，也是精氣化生的能量、血液運(yùn)行的動(dòng)力?！端貑?wèn)·平人氣象論》記載：“心臟血脈之氣也”，心氣充盛，心臟才能進(jìn)行正常的舒縮活動(dòng)，以此保持正常的心力、心率和心律，血液才能在脈內(nèi)正常運(yùn)行。王冰注《素問(wèn)·五臟生成篇》記載：“氣行血乃流”?；熀笃谛臍馓撍o(wú)力動(dòng)血，心血不行，心血漸虛，無(wú)血液的濡養(yǎng)作用，心臟乃至全身的功能受到影響，最終導(dǎo)致氣血兩虛，易出現(xiàn)胸悶、心悸。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮治療作用的成分包括藁本內(nèi)酯、β-谷甾醇、阿魏酸、黃芪總黃酮(astraisoflavanin)、槲皮素等。單藥研究顯示，黃芪總黃酮可增加損傷心肌的血流灌注，減輕心肌損傷[11]。當(dāng)歸揮發(fā)油能提高PC12細(xì)胞存活率，減少受損細(xì)胞酸性自噬泡數(shù)量，抑制自噬相關(guān)蛋白自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物(Beclin-1)、自噬相關(guān)基因5(Atg5)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3B)-Ⅱ表達(dá)[12]，其中苯酞類藁本內(nèi)酯(ligustilide)可改善微循環(huán)、舒張血管、抗心肌缺血[13]。當(dāng)歸植物的不同部位含有不同含量的阿魏酸(ferulic acid)，以尾部中含量最高，阿魏酸鈉是傳統(tǒng)活血化瘀中藥當(dāng)歸和川芎提取物中主要活性成分阿魏酸的鈉鹽，具有活血、補(bǔ)血、抗炎等多種功效[14]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)衰老大鼠血管生成，增加缺血心肌微血管密度，保護(hù)損傷心肌，激活PI3K，引起下游Akt進(jìn)一步表達(dá)，信號(hào)轉(zhuǎn)至核內(nèi)，進(jìn)而引起心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)[15]。

相關(guān)研究顯示，PI3K/Akt介導(dǎo)的自噬上調(diào)被認(rèn)為是蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一[16]。有研究顯示，自噬涉及心肌肥厚、心肌疾病和缺血性心臟病等重要心肌病理學(xué)變化[17]。自噬的發(fā)生包括3個(gè)階段：①自噬成核階段，即胞漿形成自噬前體膜樣結(jié)構(gòu)，也稱為吞噬泡(phagophore)；②吞噬泡包裹正?；虍惓＜?xì)胞器，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的自噬小體(autophagosome)；③自噬小體形成后將其內(nèi)容物運(yùn)輸至溶酶體內(nèi)，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)LC3B總量通常不會(huì)有較大波動(dòng)，一般僅出現(xiàn)LC3B-Ⅰ與LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)換，或由自噬溶酶體導(dǎo)致的LC3B-Ⅱ清除，這些現(xiàn)象均間接反映了細(xì)胞自噬流狀態(tài)[18]。這兩種情況在免疫印跡法檢測(cè)中得到類似結(jié)果，但代表了不同的生物學(xué)終點(diǎn)。有研究表明，阿霉素作用于H9c2細(xì)胞導(dǎo)致自噬蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ升高，P62表達(dá)降低，誘發(fā)心臟毒性反應(yīng)[19]。有研究顯示，阿霉素注射后造成心肌纖維排列紊亂及肌漿空泡化，p-Akt與p-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2蛋白水平降低，導(dǎo)致自噬激活、心臟收縮功能下降[20]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Akt1為PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因之一，核心基因的GO基本生物學(xué)過(guò)程及KEGG通路富集顯示，PI3K/Akt通路是當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)心臟損傷的關(guān)鍵通路。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，篩選可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因，并進(jìn)行通路富集，推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心肌損傷可能與PI3K/Akt通路調(diào)控的心肌細(xì)胞自噬密切相關(guān)。