李敏雪，李劍男，周紅，肖寧，藺輝星，馬喆，范紅結(jié)，2

基于SodC單克隆抗體的胞內(nèi)勞森菌IPMA抗原檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李敏雪1，李劍男1，周紅1，肖寧1，藺輝星1，馬喆1，范紅結(jié)1，2*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225009

【目的】胞內(nèi)勞森菌（，LI）是引起豬增生性腸炎（porcine proliferative enteritis， PPE）的腸道病原菌，主要表現(xiàn)為動(dòng)物福利下降，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究通過(guò)制備鼠抗LISodC的單克隆抗體，建立一種針對(duì)LI的免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)（IPMA）抗原檢測(cè)方法，檢驗(yàn)其在臨床上的應(yīng)用性，從而為L(zhǎng)I的病原診斷提供一種科學(xué)有效的手段。【方法】選取胞內(nèi)勞森菌弱毒疫苗為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增其片段，將其克隆至原核表達(dá)載體pGex-6p-1上，成功構(gòu)建出pGex-6p-1-重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白SodC。Western Blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性，一抗使用鼠抗GST標(biāo)簽的抗體。以該重組蛋白為免疫原，免疫4—6周齡BALB/c小鼠，利用常規(guī)細(xì)胞融合技術(shù)、有限稀釋法和間接ELISA技術(shù)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并制備腹水。通過(guò)間接免疫熒光（IFA）鑒定該單抗的特異性。以該單抗為一抗，摸索并建立了LI IPMA抗原檢測(cè)方法，并評(píng)價(jià)該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性。用優(yōu)化后的IPMA方法對(duì)來(lái)自江蘇周邊地區(qū)豬場(chǎng)回腸組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的臨床價(jià)值?！窘Y(jié)果】純化后SodC蛋白濃度較高，與鼠抗GST標(biāo)簽的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明該蛋白反應(yīng)原性較好。經(jīng)3次亞克隆后最終共篩選獲得2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1D6和1F7。單抗亞型鑒定結(jié)果顯示：1D6亞型為IgA，1F7亞型為IgG3；ELISA檢測(cè)1D6單抗效價(jià)為1﹕1 024 000；1F7單抗效價(jià)為1﹕1 024 000；間接免疫熒光（IFA）結(jié)果表明2株單抗均與LI菌株發(fā)生特異性反應(yīng)，與豬霍亂沙門氏菌（,）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等豬常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng)。優(yōu)化后IPMA反應(yīng)條件為：一抗稀釋倍數(shù)為1﹕800，作用45min；二抗稀釋倍數(shù)為1﹕2 500，作用1h，此時(shí)IPMA檢測(cè)效果最佳。用該方法檢測(cè)、PEDV、TGEV、偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2（PCV2）均為陰性；最低檢測(cè)限為103個(gè)/mL，說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示146份病料中共檢測(cè)出92份陽(yáng)性樣品，3個(gè)不同豬場(chǎng)的陽(yáng)性樣品檢出率分別為65.6%、68.2%和53.7%，總體陽(yáng)性率為63.0%。普通PCR方法檢測(cè)出82份陽(yáng)性樣品，兩種方法的陽(yáng)性符合率為94.6%?！窘Y(jié)論】成功制備了鼠抗LI SodC蛋白的單克隆抗體，建立了針對(duì)LI抗原的IPMA檢測(cè)方法，并對(duì)臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)。該方法具有良好的特異性和敏感性，并具有一定的臨床價(jià)值，為實(shí)驗(yàn)室LI的分離鑒定、在感染細(xì)胞中的定位以及流行病學(xué)調(diào)查和相關(guān)檢疫提供一種有效的技術(shù)手段。

胞內(nèi)勞森菌；SodC蛋白；單克隆抗體；免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)

0 引言

【研究意義】胞內(nèi)勞森菌（, LI）是引起豬增生性回腸炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌[1-3]。該菌主要感染保育豬且寄生在回腸末端，臨床上以細(xì)胞增生和黏膜增厚為主要特征[4]。感染胞內(nèi)勞森菌的豬表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率低，嚴(yán)重影響了豬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和動(dòng)物福利，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3,5-10]。在豬群中，PPE主要呈現(xiàn)增生性出血性腸病(PHE)和豬腸道腺瘤病(PIA)兩種形式。PHE常以散發(fā)形式出現(xiàn)，其臨床癥狀和嚴(yán)重程度與動(dòng)物年齡有關(guān)[11]；而PIA是PPE臨床上最常見(jiàn)的一種形式，以生長(zhǎng)緩慢為主要特征[12-14]。該病于1931年首次報(bào)道，廣泛見(jiàn)于歐洲、北美及亞洲的一些豬場(chǎng)，呈世界范圍內(nèi)流行[15-16]。近年來(lái)，我國(guó)集約化豬場(chǎng)中該病的發(fā)生率呈不斷升高趨勢(shì),普遍存在亞臨床型感染。郭建超等[17]采集廣東不同地區(qū)、不同日齡的577份豬糞便樣品進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示總體陽(yáng)性率為16.29%；曲向陽(yáng)等[18]調(diào)查華東地區(qū)三省一市規(guī)?；i場(chǎng)的PPE感染情況，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)糞便樣品的總體陽(yáng)性率達(dá)59.81%；黃忠等[19]采用ELISA方法對(duì)華南5省區(qū)的22個(gè)豬場(chǎng)的1 100份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)22個(gè)豬場(chǎng)抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。SodC蛋白是抗氧化系統(tǒng)的主要成員。研究顯示SodC是布魯氏菌重要的毒力因子，影響該菌的胞內(nèi)存活，能夠保護(hù)細(xì)菌免受過(guò)氧化氫的損傷，亦為重要的保護(hù)性抗原[20]。研究表明，感染LI的腸上皮細(xì)胞對(duì)Cu提取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活與胞內(nèi)勞森菌內(nèi)Zn/Cu-SOD的高表達(dá)有關(guān)，表明LI通過(guò)吸收胞漿內(nèi)的Cu，表達(dá)SodC，逃避宿主細(xì)胞中超氧基團(tuán)的損傷[21]。胞內(nèi)勞森菌是嚴(yán)格胞內(nèi)寄生菌，目前無(wú)法在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，需要依賴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)[22]，檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)LI是該菌成功分離與培養(yǎng)的前提。【前人研究進(jìn)展】目前，已報(bào)道建立了PCR、qPCR、LAMP等方法檢測(cè)該菌。孫娜等[23]根據(jù)16SrRNA建立PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)限為32.8μg·L-1；彭忠等[24]建立了巢式PCR方法，從糞便中檢測(cè)該菌的最低限為2.2×102拷貝/μL；PEDERSEN等[25]建立了qPCR方法，能對(duì)LI進(jìn)行定量分析；LI等[26]建立了LAMP方法，可以用于豬糞便中的LI檢測(cè)。但PCR僅用于感染排菌期豬糞便樣品檢測(cè)，檢測(cè)陰性并不能說(shuō)明未感染。此外，糞便中存在PCR抑制因子，可造成假陰性，且不適合大批樣品的檢測(cè)[27-30]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】LI可感染特定細(xì)胞系，如IPEC-J2、PK-15、McCoy等。臨床上從病料中分離該菌常用小鼠腸上皮細(xì)胞McCoy，因此可用IPMA對(duì)McCoy中分離的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。與PCR、IFA等檢測(cè)方法相比，IPMA特異性好，敏感性高，操作簡(jiǎn)便，判斷直觀，結(jié)果可以長(zhǎng)期保存[31-36]。同時(shí)適合大量樣品篩查，特別是臨床上大規(guī)模分離、鑒定該菌。目前國(guó)內(nèi)外建立的IPMA方法均用于PPE的血清流行病學(xué)調(diào)查，未有針對(duì)LI抗原IPMA方法的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】LI特殊的培養(yǎng)特性給該菌的分離、培養(yǎng)帶來(lái)一定的困難。目前國(guó)內(nèi)對(duì)其臨床感染情況的相關(guān)研究報(bào)道還很少，仍處于初級(jí)階段，研究LI的病原檢測(cè)方法對(duì)于防治PPE顯得尤為重要。本試驗(yàn)基于制備的SodC特異性單克隆抗體，建立了一種針對(duì)LI的IPMA檢測(cè)方法，可用于LI的實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胞內(nèi)勞森菌疫苗株（B3903），購(gòu)于Boehringer Ingelheim公司；SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)；McCoy細(xì)胞購(gòu)自ATCC；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自南京迅貝生物科技有限公司；3-氨基-9-乙基咪唑（AEC）顯色劑試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液購(gòu)自凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年3—6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.3 SodC蛋白的原核表達(dá)及純化

以豬胞內(nèi)勞森菌弱毒疫苗為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增片段，鑒定為陽(yáng)性后切膠回收片段。以pGex-6p-1為載體，酶切并連接pGex-6p-1和上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建pGex-6p-1-重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5ɑ，PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，含有重組質(zhì)粒的BL21命名為pGex-6p-1-/BL21。

將重組菌pGex-6p-1-/BL21接種到含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6—0.8時(shí)，加入終濃度0.5 mmol·L-1IPTG，于16℃、90 r/min誘導(dǎo)18 h，離心收集菌體，超聲破碎后進(jìn)行SDS - PAGE電泳鑒定。

1.4 重組SodC蛋白的Western Blot 分析

純化后的SodC蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，Western Blot分析該單抗與蛋白的反應(yīng)原性。一抗使用鼠抗GST標(biāo)簽的抗體，顯色液使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液。

1.5 鼠抗SodC蛋白單抗的制備

使用GST親和層析柱對(duì)重組SodC進(jìn)行純化。純化后SodC蛋白免疫4—6周齡BALB/c小鼠，采用皮下多點(diǎn)注射方式，免疫劑量為50 μg/只。一免后第14和21天各加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量與免疫途徑同首免。三免后7 d選取效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，采用腹腔注射的方式，免疫劑量為100μg/只，沖擊免疫后3 d取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。以間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3—5次亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。以1×106個(gè)/只的數(shù)量注射小鼠腹腔，制備腹水單抗，檢測(cè)效價(jià)。

1.6 SodC蛋白單克隆抗體的鑒定

1.6.1 單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型鑒定，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6.2 單克隆抗體特異性鑒定 采用常規(guī)間接免疫熒光（IFA）鑒定單抗與LI反應(yīng)的特異性，陰性對(duì)照孔用，PEDV，TGEV感染細(xì)胞。

1.7 IPMA檢測(cè)方法的建立

1.7.1 IPMA檢測(cè)反應(yīng)板的制備

（1）將McCoy細(xì)胞從液氮中取出復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)，傳代5次后即可使用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的McCoy細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×104—1×105個(gè)/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；

（2）形成單層細(xì)胞后，加入稀釋后的豬LI弱毒疫苗，菌量為103.9TCID50/mL，陰性對(duì)照孔加入等量的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)板室溫2 000×離心10—15 min，置于含8.0%O2、8.8%CO2和83.2%N2的環(huán)境三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；

（3）更換培養(yǎng)液為含萬(wàn)古霉素（100 μg·mL-1）、新霉素（50 μg·mL-1）和兩性霉素B（2 μg·mL-1）的培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h；

（4）加入0.1% PBS稀釋的Triton X-100，室溫透化10 min；

（5）加入4%多聚甲醛在室溫固定15 min，干燥后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 IPMA檢測(cè)步驟 取出IPMA反應(yīng)板于室溫預(yù)熱，按1﹕800比例加入SodC腹水單抗，37℃孵育1 h；按1﹕2 500比例加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h；加入AEC底物，室溫顯色20 min，甩去底物，加入PBS終止反應(yīng)，加入蘇木素染液染色30 s，徹底干燥后用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。每個(gè)步驟之間需用PBS清洗3次。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：SodC單抗與感染細(xì)胞的細(xì)菌反應(yīng),胞核呈藍(lán)色，胞漿呈棕紅色；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：SodC單抗與健康細(xì)胞不反應(yīng)，胞核呈藍(lán)色，胞漿不著色。

1.8 IPMA反應(yīng)條件的確定

1.8.1 一抗及二抗工作濃度的測(cè)定 制備IPMA反應(yīng)板，將一抗分別進(jìn)行1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400、1﹕600、1﹕800、1﹕1 000、1﹕2 000稀釋，按照IPMA操作程序，分別加入1﹕500、1﹕1 000、1﹕2 500、1﹕3 000、1﹕4 000、1﹕5 000、1﹕6 000稀釋的二抗，進(jìn)行IPMA檢測(cè)，確定一抗及二抗的最佳稀釋度。

1.8.2 一抗最佳孵育時(shí)間的確定 制備IPMA反應(yīng)板，加入最佳工作濃度一抗，于37℃作用30、45、60、90、120 min，進(jìn)行IPMA操作，確定一抗最佳孵育時(shí)間。

1.8.3 二抗最佳孵育時(shí)間的確定 制備IPMA反應(yīng)板5塊，將二抗稀釋到最佳工作濃度，分別于37℃作用30、45、60、90、120 min，按照IPMA操作程序，確定二抗最佳孵育時(shí)間。

1.8.4 IPMA方法的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 用，PEDV，TGEV，PCV2分別進(jìn)行IPMA檢測(cè)，確定其特異性；將胞內(nèi)勞森菌培養(yǎng)物稀釋為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個(gè)菌，進(jìn)行IPMA檢測(cè)，確定其最低檢測(cè)限；取不同批次和相同批次制備的IPMA反應(yīng)板進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，比較檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

1.8.5 IPMA對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 分別從江蘇3個(gè)不同地區(qū)豬場(chǎng)采集146份豬回腸組織樣品，用優(yōu)化后的IPMA對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 SodC蛋白表達(dá)與純化

SDS - PAGE電泳結(jié)果（圖1）顯示，在40 kD左右可見(jiàn)一條蛋白條帶，與目的蛋白大小一致，表達(dá)量高，主要以上清形式表達(dá)。純化后的蛋白濃度達(dá)1.02 mg·mL-1,純度較高，可作為免疫原免疫動(dòng)物。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGex-6p-1空載體質(zhì)粒；2：未誘導(dǎo)的重組表達(dá)質(zhì)粒；3：誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌液；4：誘導(dǎo)表達(dá)后的上清；5：誘導(dǎo)表達(dá)后的包涵體；6：純化后的SodC蛋白

2.2 單克隆抗體的Western Blot分析

采用Western Blot方法檢測(cè)SodC蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示，SodC蛋白與一抗抗發(fā)生了特異性結(jié)合，在40 kD處出現(xiàn)一條明顯的單一蛋白條帶（圖2），結(jié)果與預(yù)期大小相符，進(jìn)一步證明該蛋白在原核載體中成功表達(dá)，并具有良好的抗原性。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：SodC純化蛋白；2：空白對(duì)照

2.3 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

經(jīng)篩選獲得1D6和1F7這2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。免疫小鼠制備腹水，間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，1D6單抗效價(jià)為1﹕1 024 000，1F7單抗效價(jià)為1﹕1 024 000。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)過(guò)亞型鑒定，1D6、1F7單抗重鏈亞型分別為IgA鏈、IgG3鏈，2株單抗輕鏈均為κ鏈。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

IFA結(jié)果顯示，2株單抗均能與LI發(fā)生反應(yīng)，胞核呈藍(lán)色，胞漿內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光，而與.、PEDV、TGEV無(wú)特異性反應(yīng)（圖3）。

A：1D6與LI感染細(xì)胞反應(yīng)；B：1F7與LI感染細(xì)反應(yīng)；C-E：?jiǎn)慰狗謩e與S.Cholerasuis、PEDV、TGEV反應(yīng)；F：陰性對(duì)照

2.6 IPMA反應(yīng)條件的確定

經(jīng)優(yōu)化后最終確定IPMA反應(yīng)條件為：一抗稀釋濃度1﹕800，作用45min；二抗稀釋濃度為1﹕2 500，作用1h時(shí)，此時(shí)IPMA顯色效果最佳（圖4、5）。

A：?jiǎn)慰古cLI感染細(xì)胞反應(yīng)；B：?jiǎn)慰古c健康細(xì)胞反應(yīng)

A：?jiǎn)慰古cLI感染細(xì)胞反應(yīng)；B：?jiǎn)慰古c健康細(xì)胞反應(yīng)

2.7 IPMA的特異性

IPMA方法除了與LI發(fā)生特異性反應(yīng)外，與PEDV、TGEV、PCV2、PRV均無(wú)交叉反應(yīng)，表明建立的IPMA方法具有良好的特異性（圖6）。

2.8 IPMA的敏感性

將LI以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個(gè)/mL共6個(gè)梯度胞內(nèi)勞森菌感染細(xì)胞，經(jīng)IPMA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌濃度稀釋至為103個(gè)/mL時(shí)，鏡下可見(jiàn)較少的棕紅色反應(yīng)，而當(dāng)細(xì)菌濃度稀釋至為102個(gè)/mL時(shí)，未見(jiàn)棕紅色反應(yīng)，說(shuō)明該方法最低檢測(cè)限為103個(gè)/mL（圖7）。

A：?jiǎn)慰古cLI感染細(xì)胞反應(yīng)；B-F：?jiǎn)慰狗謩eS.Cholerasuis、PEDV、TGEV、PCV2 、PRV感染細(xì)胞反應(yīng)

2.9 IPMA的重復(fù)性

通過(guò)檢測(cè)IPMA 96孔檢測(cè)板的批間和批內(nèi)重復(fù)性，3次檢測(cè)結(jié)果顯示，IPMA反應(yīng)板批間與批內(nèi)檢測(cè)結(jié)果一致,重復(fù)性良好。

2.10 IPMA對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

用優(yōu)化后的IPMA方法對(duì)豬回腸組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，146份病料中共檢測(cè)出92份陽(yáng)性樣品，3個(gè)不同地區(qū)屠宰場(chǎng)的陽(yáng)性樣品檢出率分別為65.6%、68.2%和53.7%，總體陽(yáng)性率為63.0%。普通PCR方法檢測(cè)出82份陽(yáng)性樣品，兩種方法的陽(yáng)性符合率為94.6%，陰性符合率為91.5%。（表1）

A-F：?jiǎn)慰狗謩e與1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個(gè)/mL LI感染細(xì)胞反應(yīng)

表1 IPMA對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

3 討論

LI主要感染動(dòng)物回腸末端，嚴(yán)重時(shí)可擴(kuò)展至整個(gè)腸道[3]。該菌主要定植于未成熟的腸隱窩上皮細(xì)胞中，造成腺瘤樣增生、黏膜增厚、出血性炎癥等臨床癥狀[37-38]。近年來(lái)，隨著我國(guó)生豬養(yǎng)殖規(guī)?；潭仍絹?lái)越高，大部分豬場(chǎng)存在LI感染。目前國(guó)內(nèi)對(duì)LI的流行現(xiàn)狀和致病機(jī)理等方面的研究仍處于初級(jí)階段，鑒于該病給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，LI病原診斷與檢測(cè)受到廣泛關(guān)注。LI是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生菌，但體外可感染IEC-18、IPEC-J2、PK-15、McCoy等細(xì)胞，并在這些細(xì)胞系上生長(zhǎng)增殖[39-43]。迄今為止，只有McCoy細(xì)胞被系統(tǒng)地評(píng)估了LI誘導(dǎo)的增殖，因此可用IPMA方法對(duì)LI進(jìn)行檢測(cè)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相繼建立了LI IPMA抗體檢測(cè)方法，擬用于增生性腸炎的血清流行病學(xué)調(diào)查，但敏感性存在不足[34,44]。本研究基于SodC單克隆抗體，首次建立了檢測(cè)LI的IPMA方法。通過(guò)優(yōu)化，確定一抗最佳稀釋度為1﹕800，作用45 min；二抗最佳稀釋度為1﹕2 500，作用1 h，檢測(cè)效果最佳。該單抗僅與LI發(fā)生特異性反應(yīng)，與表達(dá)的以及其他常見(jiàn)腸道病原，如PEDV、TGEV、PRV、PCV2均無(wú)交叉反應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)。此外，該方法具有較高的敏感性，其最低檢測(cè)限為103個(gè)/mL。常規(guī)PCR雖可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)LI進(jìn)行鑒定，但是細(xì)胞中基因組提取的純度會(huì)直接影響后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)，導(dǎo)致假陰性。IFA雖然也可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的LI，但是對(duì)儀器設(shè)備要求較高，檢測(cè)結(jié)果不能長(zhǎng)時(shí)間保存。且IFA二抗為熒光抗體，假陽(yáng)性結(jié)果的可能性增大；而IPMA檢測(cè)僅需要光學(xué)顯微鏡可以進(jìn)行亞細(xì)胞定位，肉眼即可判定陽(yáng)性結(jié)果，顯色板可保存幾個(gè)月。

在LI IPMA抗原檢測(cè)方法成功建立的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)不同地區(qū)豬場(chǎng)的146份回腸組織病料進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出92份陽(yáng)性樣品，總體陽(yáng)性率為63.0%；而常規(guī)PCR陽(yáng)性檢出率為56.2%，敏感性低于IPMA抗原檢測(cè)方法，可能的原因是模板基因組裂解過(guò)程中多種因素影響了PCR反應(yīng)，從而降低了檢測(cè)的敏感性。本文建立的IPMA檢測(cè)方法，當(dāng)樣品中細(xì)菌含量低于103個(gè)/mL時(shí)，亦不能發(fā)生特異性的顯色反應(yīng)。但是，實(shí)驗(yàn)室用McCoy分離臨床LI樣品時(shí)，初傳陽(yáng)性樣本細(xì)胞LI的量可達(dá)到1×103至1×104個(gè)/mL，所以本研究建立的IPMA檢測(cè)方法可用于實(shí)驗(yàn)室LI的檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究基于SodC單克隆抗體成功建立了胞內(nèi)勞森菌IPMA抗原檢測(cè)方法，該方法具有較高的特異性、敏感性和重復(fù)性，適用于實(shí)驗(yàn)室胞內(nèi)勞森菌的分離鑒定以及臨床樣品的快速檢測(cè)。

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Establishment and Preliminary Application ofIPMA Antigen Detection Method Based on SodC Monoclonal Antibody

LI MinXue1,LI JianNan1, ZHOU Hong1, XIAO Ning1, LIN HuiXing1, MA Zhe1, FAN HongJie1, 2*

1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nangjing210095;2Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal, Yangzhou University Yangzhou, Yangzhou 225009 Jiangsu

【Objective】() is an enteric pathogenic bacteria that causes porcine proliferative enteropathy (PPE), which mainly shows the decline of animal welfare and causes serious economic losses to the world swine industries.The objective of this study was to prepare monoclonal antibodies against SodC of, and to establish an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) method for detectingbase the monoclonal antibody, while test its application in clinical practice, so as to provide a scientific and effective means for the diagnosis of【Method】In this study, the commercial live attenuatedvaccine was selected as target strain.Thegene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pGex-6p-1.The recombinant plasmid pGex-6p-1-was confirmed to be constructed successfully and induced expression of recombinant SodC protein.The reactivity of the recombinant protein was analyzed by Western Blot.The primary antibody was a mouse anti-GST labeled antibody.BALB/c mice aged 4-6 weeks were immunized with purified SodC protein, and hybridoma cells were screened by conventional cell fusion, limited dilution and indirect ELISA, then ascites were prepared.It was confirmed that two monoclonal antibodies had good specificity through indirect immunofluorescence (IFA).Using the monoclonal antibody as the primary antibody, a method of IPMA for detectingwas developed, and the specificity, sensitivity and repeatability of the method were evaluated.The optimized IPMA method was used to detect ileal tissue samples from pig farms in Jiangsu Province and to evaluate the clinical value of the method.【Result】After purification, the concentration of SodC protein was higher, and it specifically bound to the antibody against GST tag, indicating that the protein had good regenicity.After three times of subcloning, two strains positive hybrid tumor cells were screened, named 1D6 and 1F7, respectively.The titers of two monoclonal antibodies were both reached 1﹕204 000 by ELISA.The subclass identification results of antibodies showed the subclass of 1D6 was IgA，and subclass of 1F7 was IgG3.The result IFA showed that 1D6 and 1F7 had specific reaction with, but did not cross-react with, PEDV and TGEV.The ascites of the two monoclonal antibodies were both 1﹕1 024 000 by ELISA; IFA confirmed that the two monoclonal antibodies had good specificity.The optimized IPMA reaction conditions showed that when the dilution ratio of the primary antibody was 1:800 for 45 min, and the dilution ratio of the secondary antibody was 1﹕2 500 for 1h, the established IPMA exhibited the best performance.The specificity and sensitivity tests showed that, PEDV, TGEV, PCV2 and PRV were all negative, and the minimum detection limit was 103.The optimized IPMA method was used to detect the ileum tissue samples from pig farms in the surrounding areas of Jiangsu Province.A total of 92 positive samples were detected from 146 samples of ileal tissues.The positive rates of 3 different pig farms were 65.6%, 68.1% and 53.7%, respectively, and the overall positive rate was 63.0%.82 positive samples were detected by PCR method.and the positive coincidence rate of the two methods was 94.6%.These results indicated that this method had clinical value.【Conclusion】The monoclonal antibodies against the recombinant SodC protein were successfully prepared, and the IPMA method forwas established with good specificity and sensitivity, and the clinical samples were tested.In summary, these results further proved that the IPMA had certain clinical value, and provided an effective technical means for the isolation and identification ofin the laboratory, localization in infected cells, epidemiological investigation and quarantine.

; SodC protein; monoclonal antibody; an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA)

2020-09-09；

2021-04-12

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(19)2020）、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2017341）

李敏雪，Tel：13218030982；E-mail：2018107038@njau.edu.cn。通信作者范紅結(jié)，Tel：025-84399592；E-mail：fhj@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）