趙立群，邱艷紅，張曉飛，劉慧，楊靜靜，張建，張海軍，徐秀蘭，溫常龍

TaqMan探針法實時熒光定量PCR檢測西瓜潛隱病毒

趙立群1，邱艷紅2,3*，張曉飛2，劉慧2，楊靜靜2，張建2,3，張海軍2,3，徐秀蘭2,3，溫常龍2,3*

1北京市農(nóng)業(yè)技術推廣站，北京 100029；2北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心/國家蔬菜工程技術研究中心，北京 100097；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜種子質量監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100097

【目的】西瓜潛隱病毒（cryptic virus，CiLCV）是近年來新發(fā)生的一種重要種傳病害，研究旨在建立基于TaqMan探針法的實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes，TaqMan-qPCR）檢測技術，為開展種子、種苗帶毒鑒定和病害防控提供技術支撐?！痉椒ā客ㄟ^基于小RNA高通量測序技術在北京西瓜產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)了CiLCV，并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全長序列，設計特異性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR檢測方法。以黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottled mosaic virus）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus）、甜瓜內源病毒（endornavirus）、瓜類褪綠病毒（cucurbit chlorotic yellows virus）、南瓜花葉病毒（squash mosaic virus）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus）、西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus）、小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus）8種常見病毒為對照進行檢測方法特異性分析；利用建立的實時熒光定量標準曲線對方法靈敏度進行評價；進一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技術監(jiān)測我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)的西瓜、黃瓜、甜瓜和南瓜（砧木）種苗帶毒情況?！窘Y果】通過分析獲得的高質量小RNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)17條組裝的contig與CiLCV基因組有較好同源性。進一步克隆獲得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全長（分別為1 603和1 466 nt），發(fā)現(xiàn)其與河南省鑒定出的CiLCV同源性高達99.4%和99.8%（GenBank number KY081285、KY081284）。建立的RT-PCR檢測技術對CiLCV有單一擴增條帶；建立的TaqMan-qPCR檢測技術具有較好特異性和靈敏度，且能夠檢測到最低拷貝數(shù)為2×103的病毒，靈敏度是RT-PCR的100倍。同時，發(fā)現(xiàn)有1份來自北京的西瓜種苗檢出了CiLCV，而其余地區(qū)的西瓜、黃瓜、甜瓜和南瓜（砧木）種苗均未檢出該病毒，表明我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)種苗帶毒情況總體不高。【結論】建立的TaqMan-qPCR檢測CiLCV技術特異性強、靈敏度高，適用于口岸和實驗室開展CiLCV快速檢測和精準鑒定。鑒于CiLCV可以通過種子、種苗等傳播方式快速擴散，我國應重視種子、種苗的帶毒檢測，防止帶毒種子、種苗流入生產(chǎn)環(huán)節(jié)進而調運擴散至全國，給產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。

西瓜潛隱病毒；實時熒光定量PCR；TaqMan探針法；葫蘆科作物；種傳病害

0 引言

【研究意義】西瓜潛隱病毒（cryptic virus，CiLCV）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型雙鏈RNA病毒，可引起西瓜植株葉片皺縮和馬賽克狀壞死[1-2]。2013年最早在以色列被發(fā)現(xiàn)和報道，2017年在我國河南省首次被檢出[1-2]。最近，該病毒陸續(xù)在歐洲、亞洲等多個國家被檢出，而且呈現(xiàn)檢出率高、種子傳播等特點[1,3]。目前，已有多項研究報道指出CiLCV常與西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、甜瓜蚜傳黃化病毒（melon aphid-borne yellows virus，MABYV）、甜瓜壞死斑點病毒（melon necrotic spot virus，MNSV）混合發(fā)生，極易對西瓜生產(chǎn)造成嚴重危害[1-3]；該病毒能否侵染其他葫蘆科作物尚不明確，亟需開展系統(tǒng)研究。因此，建立一種準確、靈敏、快速的CiLCV檢測技術，監(jiān)測主要葫蘆科作物西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜砧木的種苗攜帶CiLCV情況，可從源頭防止病害的發(fā)生和傳播，對于病害的科學防控和抗病育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】2013年，以色列研究者利用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)感染MNSV的西瓜植株上存在一種新型雙鏈RNA病毒，即CiLCV，該病毒依賴RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）和外殼蛋白（capsid protein，CP）序列分別與蘿卜潛隱病毒（cryptic virus，RsCV）、辣椒潛隱病毒（pepper cryptic virus，PCV）同源性較高，因此被命名為西瓜潛隱病毒[1]。2017年，Xin等[3]進一步獲得了CiLCV的全基因組序列，并建立了CiLCV RT-PCR檢測技術，通過對66份西瓜樣品進行檢測，其中37份樣品檢出了CiLCV，檢出率高達56%，且10個不同品種的西瓜種子均可傳播CiLCV。目前，CiLCV的檢測方式僅有RT-PCR和高通量測序技術[1-3]。盡管RT-PCR技術具有檢測便捷、操作簡單的優(yōu)勢，但檢測靈敏度不強，對于低豐度病毒樣品的檢測效率不高。高通量測序技術雖然具有檢測靈敏度強、檢測范圍廣、效率高的特點，但檢測過程耗時費力，成本較高，不適于口岸或田間進行快速檢測和鑒定[4]。近年來，實時熒光定量PCR技術因其高靈敏度、高特異性以及可定量分析等優(yōu)點，成為檢測植物病原的重要技術之一[4-11]。王艷嬌等[5]研究建立了柑橘脈突病毒（citrus vein enation virus，CVEV）的實時熒光定量PCR檢測技術；丁天波等[6]應用實時熒光定量PCR技術建立了番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）鑒定體系；李文學等[8]建立了葡萄霜霉病菌（）的實時熒光定量PCR檢測技術；賀振等[11]建立了蓮藕中甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）實時熒光定量PCR檢測技術。另外，基于TaqMan探針法實時熒光定量PCR檢測技術（TaqMan-qPCR）具有顯著降低熒光背景信號干擾的優(yōu)勢，顯著增強了檢測病毒的靈敏度、穩(wěn)定性和準確性[12-15]。王英超等[14]利用TaqMan-qPCR技術建立的大蒜黑腐病菌（）檢測方法靈敏度可達140 pg。【本研究切入點】近年來，農(nóng)作物種苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，特別是蔬菜種苗年交易量約3 000億株，產(chǎn)值近2 000億元。種苗帶毒現(xiàn)象已經(jīng)成為影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問題，但目前有關種苗帶毒或帶菌的研究鮮有報道。亟需建立CiLCV快速、高效檢測方法?！緮M解決的關鍵問題】根據(jù)CiLCV保守序列設計特異性擴增引物，構建高靈敏度、穩(wěn)定性的TaqMan-qPCR檢測技術；利用該技術研究我國主要葫蘆科作物種苗攜帶CiLCV情況，為從源頭控制該病傳播避免其擴散流行提供技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2019年2月至2021年2月在北京市農(nóng)林科學院蔬菜種質改良北京市重點實驗室和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜種子質量監(jiān)督檢驗測試中心完成。

1.1 試驗材料

CiLCV為本研究組2019年在北京發(fā)現(xiàn)，供試CGMMV、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、甜瓜內源病毒（endornavirus，CMEV）、瓜類褪綠病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）、南瓜花葉病毒（squash mosaic virus，SqMV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）、WMV、ZYMV為實驗室保存。

12份西瓜、甜瓜、黃瓜與南瓜砧木種苗為北京、山東、遼寧3個?。ㄖ陛犑校┖J科作物種苗主產(chǎn)區(qū)隨機選取，作為檢測鑒定種苗攜帶CiLCV的試驗材料（表1）。

表1 主要葫蘆科作物待測種苗信息表

1.2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank公布的CiLCV兩條鏈的基因序列，設計了該病毒RT-PCR檢測的特異引物對、基于TaqMan探針法的PCR引物和探針、用于擴增dsRNA1和dsRNA2全長的引物對。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

1.3 植物總RNA提取

利用TRIZOL法（Invitrogen，美國）提取植物總RNA。具體方法為將葉片加液氮速凍后研磨成粉末狀，并加入1 ml的Trizol試劑和200 μL氯仿振蕩混勻；離心后取上清，加入等體積的異丙醇，放于-20℃冰箱沉淀；最后，用75%的乙醇洗滌沉淀兩次，溶于50 μl DEPC處理的ddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 高通量測序

小RNA建庫試劑盒購自Illumina公司（TruSeq Small RNA Sample Prep Kits，美國）。將提取的植物總RNA 利用Agilent 2100進行質檢，合格的樣品連接5′和3′接頭，并進行反轉錄和PCR，產(chǎn)物經(jīng)過電泳和回收后上機測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2000（Illumina 公司，美國）。測序的數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)過過濾雜質等獲得clean reads；將clean reads通過軟件Velvet進行短序列組裝（k-mer值設為17）[16]。組裝的重疊群（contig）與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的病毒信息進行比對，從而分析出潛在的已知病毒或類病毒，或者發(fā)現(xiàn)新的病毒或類病毒；并進一步通過生物學試驗進行驗證。

表2 CiLCV檢測引物序列

1.5 RT-PCR

利用HiScript?II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）（諾唯贊，中國）進行RT-PCR反應。50 μL反應體系：2×One Step Mix（Dye Plus）25 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，RNA模板1 μL（100 ng·μL-1），One Step Enzyme Mix 2.5 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件：50℃預變性30 min；94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃ ∞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

1.6 克隆與測序

利用CiLCV全長克隆引物對CiLCV-R1-F/R和CiLCV-R2-F/R（表2）進行RT-PCR擴增，將PCR產(chǎn)物回收并克隆到PCE2TA/Blunt-Zero vector載體上（諾唯贊，中國），獲得質粒pCiLCV-R1和pCiLCV-R2。測序后獲得該病毒dsRNA1和dsRNA2全長序列信息，并與Xin等[3]報道的CiLCV病毒序列進行同源性比對分析。

1.7 TaqMan-qPCR檢測

1.7.1 TaqMan-qPCR反應體系和程序 利用實時熒光定量PCR儀CFX96 Touch（伯樂公司，美國）進行CiLCV TaqMan-qPCR檢測技術研究。一步法TaqMan-qPCR使用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（諾唯贊，中國）。反應體系：2×One Step Q Probe Mix 10 μL；One Step Q Probe Enzyme Mix 1 μL；50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL；正向引物（10 μmol·L-1）0.4 μL；反向引物（10 μmol·L-1）0.4 μL；探針（10 μmol·L-1）0.4 μL；ddH2O補足20 μL。反應程序：50℃反轉錄15 min；95℃變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s（收集熒光信號），40個循環(huán)。普通TaqMan-qPCR采用2×Real Star Probe Fast Mixture（with ROXII）（ABI公司，美國）。反應體系：2×Real Star Probe Fast Mixture（with ROXII），10 μL；正向引物10 μmol·L-1，0.5 μL；反向引物 10 μmol·L-1，0.5 μL；探針（10 μmol·L-1）0.5 μL；ddH2O補足20 μL。反應程序：95℃變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s（收集熒光信號），40個循環(huán)。

1.7.2 TaqMan-qPCR特異性檢測 以感染CiLCV的西瓜葉片總RNA為陽性對照，以感染CGMMV、CMV、CMEV、CCYV、SqMV、TSWV、WMV、ZYMV的植物總RNA為試驗材料，進行TaqMan-qPCR檢測分析，根據(jù)其他病毒是否呈現(xiàn)有效擴增，綜合確定TaqMan-qPCR技術的檢測特異性。

1.7.3 TaqMan-qPCR靈敏度檢測 以CiLCV dsRNA1的克隆載體pCiLCV-R1為模板（濃度約為11.8 ng·μL-1，溶液1），用無菌水以10倍梯度進行稀釋，獲得溶液2—7，濃度依次約為11.8×10-1—11.8×10-6ng·μL-1。

以溶液1—7為模板，按照普通TaqMan-qPCR反應體系進行方法的靈敏度檢測。以CiLCV克隆載體pCiLCV-R1的拷貝數(shù)為橫坐標，循環(huán)數(shù)Cq值為縱坐標，繪制標準曲線。質粒拷貝數(shù)=[質粒濃度（ng·μL-1）×質粒體積（μL）×6.02×1023]/[（載體長度bp+片段長度bp）×660 g·mol-1]。同時，利用上述稀釋溶液進行PCR檢測，比較TaqMan-qPCR檢測靈敏度。

2 結果

2.1 西瓜田間癥狀與病毒鑒定

2019年在北京西瓜田進行病害調查時發(fā)現(xiàn)部分西瓜植株表現(xiàn)出葉片卷曲、畸形和變小等癥狀（圖1-A、1-B和1-C）。提取疑似感染病毒病害的西瓜葉片的總RNA，并進行小RNA測序。獲得初始reads約為24 545 770條，測序數(shù)據(jù)過濾后獲得22 860 908條，占總測序數(shù)據(jù)的93.14%。進一步對獲得序列的長度和數(shù)量進行分析，發(fā)現(xiàn)獲得的小RNA的長度主要分布在18—30 nt，其中長度為24 nt的小RNA含量約為12 514 525 reads，占總clean reads的54.74%；其次為21 nt的小RNA含量約為3 413 397，占clean reads的14.93%（圖1-D），表明測序數(shù)據(jù)可達到后續(xù)分析要求。

A、B/C為西瓜植株感染CiLCV癥狀A、B/C are the symptoms of watermelon infected with CiLCV；D為小RNA測序片段長度分布圖D is the length distribution of small RNAs sequencing

使用Velvet 軟件（k-mer值設為17）對小RNA進行組裝，獲得contig與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTn和BLASTx比對，發(fā)現(xiàn)有17條contig序列與CiLCV基因組具有同源性，未發(fā)現(xiàn)其他病毒。根據(jù)NCBI上發(fā)表的CiLCV序列，設計可特異性擴增RNA1部分序列的引物對CiLCV-588-F/R（表2），利用RT-PCR技術對樣品進行擴增驗證，獲得588 bp的PCR產(chǎn)物（圖2），通過測序和BLASTn分析，發(fā)現(xiàn)與CiLCV的dsRNA1高度同源（GenBank number KY081285）。

CiLCV屬于雙分病毒科（），其基因組由兩條dsRNA片段組成。其中dsRNA-1全長1 603 nt，含有一個編碼RdRp的ORF；dsRNA-2全長1 466 nt，含有一個編碼CP的ORF。根據(jù)已發(fā)表的CiLCV基因組序列信息，設計引物對CiLCV-R1-F/R和CiLCV-R2-F/R（表2）用于擴增CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全長，并克隆到載體上進行測序。分別獲得約1 603和1 466 bp的產(chǎn)物，經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)與Xin等[3]在河南省鑒定出的CiLCV dsRNA1和dsRNA2序列信息（GenBank number KY081285、KY081284）同源性分別高達99.4%和99.8%。

M：DL2000 marker；1—3：樣品1—3的PCR擴增產(chǎn)物The PCR amplified product of samples 1-3；4、5：陰性對照Negative control group

2.2 CiLCV TaqMan-qPCR檢測特異性

設計基于CiLCV-dsRNA1的兩對探針引物（序列見表2），建立了CiLCV的TaqMan-qPCR檢測技術。利用兩對探針引物對CiLCV陽性樣品進行TaqMan-qPCR擴增檢測，以其他8種常見病毒（CGMMV、CMV、CMEV、CCYV、SqMV、TSWV、WMV、ZYMV）樣品作為對照，研究引物的特異性。結果表明兩對探針在CiLCV陽性樣品中存在有效擴增（藍色和紅色曲線）；但探針1特異性在含有其他8種病毒樣品中有擴增（綠色曲線），探針2在其他樣品無有效擴增（綠色曲線）（圖3-A）；表明探針2的特異性優(yōu)于探針1；此外，陽性樣品利用探針1的檢測Cq值約20.51（藍色曲線），而探針2的檢測Cq值約15.85（紅色曲線），說明探針2的靈敏度也高于探針1。因而，將陽性樣品的總RNA（濃度約100 ng·μL-1）進行10倍梯度稀釋，檢測兩個探針的靈敏度。結果證明當總RNA稀釋到1×10-1ng·μL-1時，探針1的Cq值為31.34（藍色），而探針2的Cq值為27.75；而當總RNA稀釋到1×10-2ng·μL-1時，探針2的Cq值接近32，表明探針2的靈敏度優(yōu)于探針1（圖3-B）。

藍色和紅色曲線分別對應CiLCV的探針1和探針2的擴增結果，綠色曲線代表其他8種病毒擴增曲線The blue and red curves indicate the amplification results of primer set 1 and primer set 2 for CiLCV, respectively, while the green curves indicate the amplification results of the other eight viruses

2.3 CiLCV TaqMan-qPCR檢測靈敏度

由圖3可知，探針2在檢測感病樣品的特異性和靈敏度上顯著優(yōu)于探針1。為進一步研究CiLCV TaqMan-qPCR檢測技術的最低檢測限度，排除不同感病樣品總RNA對檢測結果的影響，進一步構建了CiLCV的克隆載體建立探針2的標準曲線。利用RT-PCR技術擴增CiLCV-dsRNA1全長，并克隆到載體上。獲得CiLCV的質粒pCiLCV-R1，濃度約為11.8 ng·μL-1，根據(jù)質?？截悢?shù)公式可計算出溶液1中1 μL質粒的拷貝數(shù)為2×109。以此為溶液1，進行10倍梯度稀釋，依次獲得溶液2—7。以溶液1—7為模板進行TaqMan-qPCR。由建立的標準曲線可知（圖4-B），隨著CiLCV樣品濃度降低，Cq值逐漸遞增且兩者之間呈現(xiàn)良好線性關系，標準曲線斜率為-3.506，決定系數(shù)2=0.996，建立的方程為=-3.506+32.608（其中代表Cq值，代表拷貝數(shù)）。結果表明，TaqMan- qPCR檢測技術最低可檢出溶液7，即最低可檢測出2×103個拷貝的病毒（圖4-A）。而RT-PCR引物對質粒pCiLCV-R1進行擴增時，溶液5可見清晰擴增條帶，溶液6時僅有微弱且不穩(wěn)定的擴增條帶（圖5）。表明TaqMan-qPCR技術檢測CiLCV的靈敏度是RT-PCR技術的100倍。

溶液1—7的模板濃度依次為11.8×100—11.8×10-6 ng·μL-1 The template concentration of solution 1-7 is 11.8×100-11.8×10-6 ng·μL-1

M：DL2000 marker；1—7：溶液1—7的PCR擴增產(chǎn)物The PCR results for sample 1-7；8：陰性對照Negative control

2.4 主要葫蘆科作物種苗攜帶CiLCV情況

CiLCV可以通過種子傳到種苗上，因而存在CiLCV隨著種子、種苗運輸在國內擴散的風險。隨機抽取了北京、山東、遼寧等我國北方葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)種苗，利用TaqMan-qPCR檢測種苗攜帶CiLCV情況，重點考察不同地區(qū)不同來源的西瓜、黃瓜、甜瓜與南瓜（砧木）是否攜帶CiLCV。以表1中列出的12份葫蘆科作物種苗為樣品，每份樣品混合提取植物總RNA，應用已建立的CiLCV RT-PCR和TaqMan-qPCR方法檢測種苗攜帶CiLCV情況。

結果發(fā)現(xiàn)有1份來自北京的西瓜種苗攜帶CiLCV，而其余11份葫蘆科作物種苗同陰性對照（無菌水）均未出現(xiàn)擴增峰型（圖6-A），該結果與RT-PCR鑒定結果一致（圖6-B），表明我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)種苗攜帶CiLCV情況總體不高，而且除西瓜外的其他葫蘆科作物如甜瓜、黃瓜和南瓜砧木種苗均未檢出CiLCV，特別是作為葫蘆科作物重要的嫁接砧木南瓜種苗未檢出CiLCV。但北京西瓜種苗檢出CiLCV的現(xiàn)象值得業(yè)界高度警惕。

A：紅色曲線表示陽性對照樣品擴增結果，藍色曲線表示12份待測樣品擴增結果，最左側藍色曲線表示感病樣品擴增結果The red curves indicate the amplification results of positive control samples, the blue curves indicate the amplification results of the 12 test samples, and the left blue curve presents the positive sample。B：CK+：陽性樣品Positive control；M：DL2000 marker；1—12：樣品1—12的PCR擴增產(chǎn)物the PCR results for sample 1-12；13：陰性對照Negative control

3 討論

目前，RT-PCR技術、實時熒光定量PCR技術（RT- qPCR）、環(huán)介導等溫核酸擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）均為檢測植物病毒的有效手段。然而，多項研究證明實時熒光定量PCR技術與RT-PCR技術相比在檢測靈敏度方面具有顯著優(yōu)勢[4-11]。王艷嬌等[5]建立的實時熒光定量PCR能夠檢出70copies/μL的CVEV，檢測靈敏度是RT-PCR的100倍；丁天波等[6]利用ToCV的外殼蛋白序列建立的實時熒光定量PCR檢測技術最低可檢出2.7×103copies/μL，靈敏度是RT-PCR的100倍；賀振等[11]建立的SPLV-lotus實時熒光定量PCR技術能夠檢測到70copies/μL的病毒，靈敏度是RT-PCR的100倍；高利利等[17]基于ToCV的HSP（heat shock protein）序列建立的實時熒光定量PCR檢測技術擴增效率高達99.8%。另外，盡管LAMP技術具有靈敏度高、特異性好、擴增時間短等優(yōu)點，應用在柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）、蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、植物青枯菌（）、草莓輕型黃邊病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）等檢測上[18-24]。但與實時熒光定量PCR技術相比，LAMP技術存在引物設計較為繁瑣，檢測成本較高，容易產(chǎn)生假陽性，而且難以進行定量分析的問題[8,25-26]。而且，基于TaqMan探針法的實時熒光定量qPCR技術具有更好的檢測靈敏度，王英超等[14]利用TaqMan-qPCR技術建立的大蒜黑腐病菌檢測方法靈敏度可達140 pg。本研究建立的TaqMan-qPCR檢測技術，對CiLCV具有較高擴增特異性，檢測靈敏度可達到2×103copies，為RT-PCR檢測技術的100倍，這一結論與前人研究結果基本一致。綜上，實時熒光定量PCR技術是一種操作便捷，特異性強，靈敏度高，并且可以進行定量檢測鑒定病害的高效技術。本研究建立的TaqMan-qPCR技術能夠快速、精準、高效鑒定CiLCV。

近年來，農(nóng)作物種苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種苗傳播成為當前病害遠距離擴散的重要方式，然而有關種苗帶毒或帶菌的研究報道較少[27-29]。有研究表明葫蘆科作物種子可以攜帶多種病毒，如CGMMV、ZYMV、CMV、SqMV、MNSV以及CiLCV等[1-3,27]。吳會杰等[27]研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆科作物西瓜、甜瓜種子的CGMMV帶毒率在93.85%以上，而傳毒率則為2.83%以下。盡管有研究表明大多數(shù)種傳病毒的傳毒率通常不高，但只要攜帶病毒的種子存在就有可能引起作物的重大損失[29-31]。Dinant等[31]研究發(fā)現(xiàn)，萵苣種子種傳率超過0.1%，就足以造成萵苣花葉病毒（lettuce mosaic virus，LMV）的流行。近年來，我國西瓜、甜瓜等葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)CGMMV，已成為制約西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大難題，多個主產(chǎn)區(qū)陸續(xù)檢出CGMMV，變成了疫區(qū)，導致這一問題的原因可能是由于種苗帶毒和遠距離流通引起的。本研究中北京抽取的一份西瓜種苗攜帶CiLCV，鑒于植物病毒可以通過多種途徑進行傳播，如農(nóng)事操作、昆蟲媒介等，一旦帶毒種苗流入生產(chǎn)環(huán)節(jié)，很可能造成病毒大規(guī)模的擴散和暴發(fā)，將對育苗企業(yè)或菜農(nóng)造成潛在重大損失。因此，在育苗早期或育苗企業(yè)全面開展基于高效精準檢測技術的病毒鑒定和監(jiān)測預警，是從源頭解決種苗帶毒和遠距離傳播的關鍵。

有研究指出植物感病早期或者處于潛育期的感病葉片往往不表現(xiàn)癥狀，而且葉片內病毒含量太低，難以采用傳統(tǒng)生物學檢測方法進行鑒定[8]。李文學等[8]建立的葡萄霜霉病菌實時熒光定量PCR技術，可以檢測到病原菌侵入葉片6 h后的低侵染量，為葡萄霜霉病的早期診斷與預測提供了技術支持。本研究構建的CiLCV TaqMan-qPCR檢測技術靈敏度高、特異性強，可以應用于檢測西瓜和其他葫蘆科作物種子、種苗、植株，同時能夠滿足檢測低豐度病毒樣品的需求。不同寄主同種病毒的傳毒率會不同，種子傳毒率還受環(huán)境條件、母株感病時間及其交互作用的影響[8,29]。本研究中甜瓜、黃瓜和南瓜砧木種苗均未檢出CiLCV，這一結果與Sela等在美國和厄瓜多爾的研究結論一致[1]。僅有來自北京一家育苗企業(yè)（序號1）的一份西瓜種苗檢出了CiLCV，表明我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)種苗的CiLCV發(fā)病率總體不高，該結果與Sela等[1]在美國和Xin等[3]在我國河南的研究結論略有不同，推測原因是CiLCV傳播至我國時間不長尚未造成大面積擴散。另外，本研究中CiLCV發(fā)病率不高可能與抽取樣本數(shù)量有限有關。因此，應盡快對我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)開展CiLCV發(fā)病情況檢測鑒定，盡早切斷該病毒的傳播擴散，防止其迭代傳播造成更強致病性。而本研究建立的CiLCV TaqMan-qPCR檢測技術可為將來開展種子、種苗帶毒快速精準鑒定提供可靠技術支持。

4 結論

針對我國最近發(fā)現(xiàn)的西瓜潛隱病毒（CiLCV）建立了基于TaqMan-qPCR的檢測技術，該檢測技術特異性強、靈敏度高，能夠滿足快速、精準、定性、定量鑒定需求，適于口岸和實驗室高效鑒定。我國葫蘆科作物主產(chǎn)區(qū)的西瓜種苗攜帶CiLCV，盡管與國外相比總體上發(fā)病率不高，但仍亟需引起重視，建議盡快開展該病毒大面積檢測鑒定，盡早控制其傳播途徑，避免其擴散流行對產(chǎn)業(yè)造成更大損失。

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The detection ofcryptic virus using TaqMan-qPCR method

Zhao LiQun1, Qiu YanHong2,3*, Zhang XiaoFei2, Liu Hui2, Yang JingJing2, Zhang Jian2,3, Zhang HaiJun2,3, Xu XiuLan2,3, Wen ChangLong2,3*

1Beijing Agricultural extension station, Beijing 100029;2Beijing Vegetable Research Center (BVRC), Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences/National Engineering Research Center for Vegetables, Beijing 100097;3Supervision, Inspection and Test Center of Vegetable Seed Quality of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100097

【Objective】cryptic virus (CiLCV) is an important seed-transmitted virus that newly-emerging in watermelon in recent years.The objective of this study is to develop a detection method for CiLCV with real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes (TaqMan-qPCR), and to provide technical supports for the CiLCV detection from seeds and seedlings, and also for disease controlling in the future.【Method】The CiLCV was found in Beijing watermelon producing area with high-throughput sequencing based on small RNAs.The full sequence of CiLCV-dsRNA1 and CiLCV-dsRNA2 was cloned and specific amplifying primers were designed to set up the detection method of the RT-PCR and TaqMan-qPCR.The other eight common viruses (cucumber green mottled mosaic virus, cucumber mosaic virus,endornavirus, cucurbit chlorotic yellows virus, squash mosaic virus, tomato spotted wilt virus, watermelon mosaic virus, zucchini yellow mosaic virus) were used as control to analyze the method specificity.the standard curve of CiLCV was performed to evaluate the method sensitivity.Furthermore, the novel detection methods of TaqMan-qPCR and RT-PCR were used to inspect CiLCV in watermelon, cucumber, melon, and rootstock pumpkin seedlings that randomly collected from the main producing areas of cucurbits crop in North China.【Result】The small RNAs data with high-quality were obtained, and 17 assembled contigs were found to share homology with CiLCV genomes after data analysis.The full-length of CiLCV-dsRNA1 and CiLCV-dsRNA2 was cloned with 1 603 and 1 466 nt in length, respectively, sharing the highest nt sequence identity (about 99.4% and 99.8%, respectively) with CiLCV that isolated from Henan province (GenBank number KY081285, KY081284).The established RT-PCR for CiLCV showed a single amplified band, while the novel TaqMan-qPCR for detecting CiLCV showed good sensitivity and specificity, and could detect about 2×103copies of CiLCV.The detection sensitivity of TaqMan-qPCR was about 100 times higher than that of RT-PCR.In addition, only one Beijing-watermelon sample was CiLCV positive, while the rest watermelon, melon, cucumber, and rootstock pumpkin seedlings were CiLCV negative, indicating that the virulence of seedlings in the main producing areas of cucurbits crop in China was not high.【Conclusion】The established TaqMan-qPCR method for CiLCV detection has high specificity and sensitivity, and is suitable for rapid detection and accurate identification of CiLCV at ports and laboratories.In view of CiLCV can spread rapidly through seeds and seedlings, China should pay more attention to the detection of virulent seeds and seedlings to prevent the virulent seeds and seedlings flowing into the production process and then being transported and spread to the whole country, which may cause great economic losses to the industry.

cryptic virus (CiLCV); real-time qPCR; TaqMan probe; cucurbits crop; seedling-borne disease

2021-03-01；

2021-04-09

科技助力經(jīng)濟2020重點專項（202006）

趙立群，E-mail：zhaoliqun2009@163.com。通信作者邱艷紅，E-mail：qiuyanhong@nercv.org。

溫常龍，E-mail：wenchanglong@nercv.org

（責任編輯 岳梅）