高 琛，周穎璐

(嵊州市畜牧業(yè)發(fā)展中心，浙江 嵊州 312400)

禽流感(Avian Influenza，AI)是禽類流行性感冒的簡稱，是由正黏病毒科，流感病毒屬，A 型流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)引起的一種禽類(家禽和野禽) 、哺乳動物的高發(fā)病率、高死亡率和高變異性的重大動物傳染病。

根據(jù)禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感(High Pathogenic Avain Influenza，HPAI)、低致病性禽流感(Low Pathogenic Avain Influenza，LPAI)或溫和型禽流感(Mildly Pathogenic Avain Influenza，MPAI)。禽流感病毒可分為16個H亞型和9個N亞型。一般情況下，由H5和H7亞型毒株(以H5N1和H7N7為代表) 所引起的禽流感稱為高致病性禽流感，發(fā)病率和死亡率高、風(fēng)險危害大。世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 將高致病性禽流感列為A類動物疫病[2]，我國將其列入一類動物疫病。幾乎每次AI的暴發(fā)，尤其是HPAI的暴發(fā)都給當?shù)仞B(yǎng)禽業(yè)帶來沉重的打擊，有時也引起人的感染、發(fā)病甚至死亡，對人類健康構(gòu)成極大威脅，因此已經(jīng)引起世界各國的高度關(guān)注[3]。AIV低毒力株能明顯降低家禽的生產(chǎn)性能，引起產(chǎn)蛋異常和肉雞死亡等，并在禽類間隱性傳播，經(jīng)抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變形成新毒株或毒力增強，也開始受到關(guān)注[4]。我國大規(guī)模的免疫措施收到了顯著的防控效果，然而我國禽流感疫情提示，活禽運輸和免疫不全面等因素是疫情的重要起因。Shingo Iwami等認為疫苗免疫雖然是控制禽流感疫情發(fā)生的有效工具，但倘若應(yīng)用不當將不利于其防控[5]。

為了解濰坊市某些種雞場種雞禽流感的免疫抗體水平，便于更好為禽流感免疫做出評價，作者在山東工作時期應(yīng)用血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)方法, 隨機抽樣對種雞進行禽流感抗體檢測和分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1被檢血清 昌邑和壽光市9個雞場種雞188羽份血清。

1.1.2試劑及耗材 H5、H9亞型禽流感標準抗原。上述抗原由廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司提供。1%雞紅細胞懸液自制。96孔微量反應(yīng)板，恒溫箱，微量移液器及配套的吸頭。

1.2試驗方法

1.2.1H5亞型禽流感抗體檢測

1.2.1.1微量血凝試驗 (HA試驗) 于微量血凝板的第一行每孔中滴加生理鹽水50 μL，吸取禽流感H5亞型禽流感診斷抗原50 μL滴加于第1孔，用微量移液器混勻后吸出50 μL 加入第2孔，混勻后吸出50 μL加入第3孔，以此類推，稀釋至第11孔，吸取50 μL棄去。第12孔不加抗原。于每孔加入1%紅細胞懸液50 μL。手持血凝板輕輕振蕩，放37℃ 15-20 min，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價。以上試驗做2次重復(fù)，取2次抗原血凝效價的平均值。

1.2.1.2微量血凝抑制試驗(HI試驗) 于微量血凝板的每行每孔加入生理鹽水50 μL，每行第1孔加入待檢血清50 μL，用微量移液器混勻后吸出50 μL 加入第2孔，混勻后吸出50 μL加入第3孔，以此類推，稀釋至第11孔，吸取50 μL棄去。第12孔不加血清。每行1-12孔加入濃度為4個血凝單位的抗原，每孔50 μL；每行1-12孔加入1%紅細胞，輕輕振蕩，37 ℃下作用15-20 min，判定血凝抑制效價。

1.2.2H9亞型禽流感抗體檢測 方法同上述HA試驗和HI試驗。

2 結(jié)果

昌邑和壽光市9個種雞場抽檢188羽種雞的血凝抗體檢測結(jié)果匯總于表1。

表1 昌邑和壽光市種雞場抗體檢測結(jié)果

由表1可見，這9個種雞場共抽查了188羽份種雞血清進行了血凝試驗。其中昌邑1場到7場各抽檢20份血清，H5、H9亞型禽流感免疫全部合格，合格率為100%。壽光1場抽檢30份血清，H5亞型禽流感免疫合格數(shù)量為22，合格率為73.33%，H9亞型禽流感免疫合格數(shù)量為8，免疫合格率為26.67%。壽光2場抽檢18份血清，H5亞型禽流感免疫合格數(shù)量為16，免疫合格率為88.89%，H9亞型禽流感免疫合格數(shù)量為11，免疫合格率為61.11%。

3 討論

3.1抗體檢測分析 通過試驗表明，昌邑市種雞禽流感H5、H9亞型禽流感抗體檢測平均合格率為100%。結(jié)果表明這7個種雞場的禽流感免疫做的是非常成功的，此場的肉種雞禽流感免疫程序：16 d禽流感單價疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，35 d禽流感單價疫苗H5-5胸肌、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，11 wks禽流感單價疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，20 wks禽流感單價疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射，25 wks禽流感單價疫苗H5-5胸肌注射、H9頸皮下注射，40 wks禽流感單價疫苗H5-5胸肌注射(備注：20周齡以后的免疫依照抗體檢測情況而決定是否進行再次免疫)。壽光市兩個種雞場禽流感H5亞型禽流感抗體檢測平均合格率為79.17%，H9亞型禽流感抗體檢測平均合格率為39.58%。結(jié)果表明這兩個場的禽流感免疫做的效果不是很好，此場48份血清中，H5亞型禽流感有10份抗體效價>12log2，H9亞型禽流感有29份抗體效價>12log2。從理論和實踐方面推測壽光這兩個種雞場的種雞被野毒株感染過。

壽光市這兩個種雞場的免疫程序和昌邑市7個場的免疫程序基本是相同的，疫苗和檢測抗體也是相同的。然而兩個地區(qū)的免疫合格效果卻參差不齊。昌邑市7個種雞場的禽流感H5、H9亞型禽流感抗體檢測平均合格率為100%，壽光市兩個種雞場H5亞型禽流感平均合格率79.17%、H9亞型禽流感平均合格率只有39.58%。在不同的種雞場，用相同免疫程序、疫苗和檢測抗體，卻造成了免疫效果的不同。通過理論和實踐分析免疫效果不同的原因，可能有以下幾個方面：

(1)飼養(yǎng)管理，昌邑市7個種雞場在日常工作中能夠按照種雞的飼養(yǎng)管理方法來對雞場的種雞進行飼養(yǎng)管理。平時能夠及時地打掃雞舍的衛(wèi)生，能夠按時對雞舍進行消毒，嚴格控制種雞場的溫度。而壽光市2個種雞場在這些方面做得不夠全面，特別是對于雞舍的按時消毒。

(2)野毒早期感染或強毒株感染，雞體接種疫苗后需要一定時間才能產(chǎn)生免疫力，而這段時間恰恰是一個潛在的危險期，一旦有野毒入侵或機體尚未完全產(chǎn)生抗體之前感染強毒，就導(dǎo)致疾病的發(fā)生，造成免疫失敗。環(huán)境中的病毒超強毒株的存在可能會使種雞機體的抗體效價高于正常標準。根據(jù)壽光市2個種雞場H5亞型禽流感抗體效價有10份>12log2，H9亞型禽流感抗體效價有29份>12log2，推測壽光市2個種雞場的種雞有早期感染或強毒感染。

(3)免疫抑制性疾病，昌邑市7個種雞場在整個飼養(yǎng)階段種雞沒有患過免疫抑制疾病，而壽光市2個種雞場在前期種雞患過傳染性法氏囊病，病毒損害了雞的免疫器官法氏囊等，從而導(dǎo)致免疫抑制。特別是傳染性法氏囊病病毒感染可以造成免疫系統(tǒng)的破壞和抑制，從而影響其它傳染病的免疫。在接種禽流感疫苗時沒有起到應(yīng)有的作用，致使種雞受到病毒感染。

(4)工作人員操作，工作人員操作不規(guī)范，導(dǎo)致接種的疫苗受到外界環(huán)境中強毒株的污染。在進行免疫時，壽光市2個種雞場的工作人員沒有進行嚴格的技術(shù)操作，對種雞接種疫苗更換雞舍時，沒有進行嚴格的消毒，另外疫苗沒有預(yù)溫，導(dǎo)致疫苗失效。

3.2抗體檢測方法的比較 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法，比其他血清學(xué)試驗敏感性好、特異性高、重復(fù)性好，特別是單克隆抗體技術(shù)和ELISA 技術(shù)的聯(lián)合，成為檢測病原的良好手段。薛松果通過配對試驗選擇1C6 和4D5 分別為包被單抗和酶標單抗，建立單抗夾心ELISA。同年蔣鳳英等報道也建立了單抗夾心ELISA，主要用于檢測雞泄殖腔棉拭子樣品。該方法與HA/HI 試驗相比，陽性符合率為99.3%，陰性符合率為99.7%，重復(fù)性試驗變異系數(shù)在8%以內(nèi)。該報道中特別提到，將新鮮的尿囊液凍融一次再進行檢測能很好的減少假陽性的發(fā)生，值得平時在工作中嘗試ELISA 方法檢測AIV，操作簡單、穩(wěn)定實用，特別適合基層獸醫(yī)部門和雞場AIV 進行血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查[13]。