于清泳，趙 輝

作者單位：226699 江蘇南通 海安市中醫(yī)院介入科（于清泳）；南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入科（趙 輝）

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移［1］。據(jù)調(diào)查60%～71%的結(jié)直腸癌發(fā)生了肝臟轉(zhuǎn)移，其中僅有10%～20%結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者可通過(guò)根治性手術(shù)切除進(jìn)行治療［2-3］。近年來(lái)，隨著介入技術(shù)的發(fā)展，TACE 已被用于治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，但整體治療效果仍不理想，患者5年生存率仍較低［4］。探尋結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的生物標(biāo)志物，可了解患者生存預(yù)后情況，有利于治療方案的制定。

含表皮生長(zhǎng)因子的纖維蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)2（EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 2，EFEMP2）又名fibulin4，是fibulin 家族中一員，主要負(fù)責(zé)調(diào)控彈性纖維的合成與排列［5-6］。目前，EFEMP2 已被證實(shí)在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)，并參與其進(jìn)展［7］。有研究證實(shí)上調(diào)EFEMP2 可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［8-10］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與TACE 治療療效密切相關(guān)。本研究分析EFEMP2和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年3月至2017年7月在海安市中醫(yī)院接受治療的152 例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床病理及影像學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移；②無(wú)法通過(guò)根治性手術(shù)切除或不接受根治性手術(shù)切除治療；③接受TACE 治療后未再次接受TACE 治療；④臨床治療、檢查及隨訪等資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②存在除肝臟以外其他臟器轉(zhuǎn)移的腫瘤病灶；③心、肝、腎功能嚴(yán)重異常；④接受放療、免疫治療或靶向治療等；⑤有自身免疫性疾病史或血液系統(tǒng)疾病；⑥臨床資料不完整、不配合完成檢查或隨訪失聯(lián)等。152 例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中男94 例，女58例，年齡52～70（61.6±4.3）歲；腫瘤單發(fā)52 例，腫瘤多發(fā)100（2～3 個(gè)）例，共268 個(gè)腫瘤病灶，腫瘤平均直徑（3.28±0.44）cm。

收集所有受試者年齡、性別、原發(fā)病灶位置、轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)、Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤直徑、AFP 和后續(xù)治療方案等信息。采用電話、復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪，了解預(yù)后情況。于患者出院后開始隨訪，每月隨訪1次，末次隨訪時(shí)間為2020年7月10日，隨訪終點(diǎn)為患者隨訪過(guò)程中死亡或至末次隨訪結(jié)束，中位隨訪時(shí)間為20（6～36）個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 TACE 治療方法 采取仰臥位，消毒，鋪巾，麻醉；血管造影下Seldinger 法置入導(dǎo)管鞘及導(dǎo)管，注入碘帕醇（上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20073014），觀察腫瘤病灶位置、大小、數(shù)量和供血?jiǎng)用}等，灌注化療藥物并進(jìn)行栓塞。化療藥物為奧沙利鉑（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20064296）、雷替曲塞（南京正大天晴制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20090325）和鹽酸吡柔比星（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10930105），栓塞劑為碘化油（煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H37022398）和明膠海綿顆粒［杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014 第3771056 號(hào)］。根據(jù)患者情況給予保肝、止吐等治療。TACE 后定期復(fù)診，行CT/MRI 檢查觀察腫瘤病灶碘油沉積及有無(wú)新發(fā)腫瘤病灶等情況［11］。

1.2.2 EFEMP2 水平檢測(cè) 抽取所有受試者TACE前（T0）、術(shù)后3 d（T1）、7 d（T2）和14 d（T3）空腹外周靜脈血10 mL，外周血中單個(gè)核細(xì)胞用Ficoll 密度梯度離心法分離［12］。用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中EFEMP2 水平［13］。用RIPA 裂解液裂解單個(gè)核細(xì)胞，分離出總蛋白，用BCA 法蛋白定量；10%SDS-PAGE 分離膠凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出膠面，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別滴加兔抗人EFEMP2 單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）和兔抗人β-actin 單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），4℃孵育過(guò)夜；滴加山羊抗兔二抗（上海信裕生物科技有限公司），室溫下孵育2 h；ELC 發(fā)光液顯影。用Image J 軟件讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組EFEMP2 水平比較

根據(jù)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者3年生存預(yù)后將其分為兩組：生存組（n=51）和死亡組（n=101）。兩組EFEMP2 水平比較，差異有時(shí)間效應(yīng)（F=1733.269，P＜0.001）、組間效應(yīng)（F=229.065，P＜0.001）和交互效應(yīng)（F=57.263，P＜0.001）。兩組EFEMP2 水平均隨時(shí)間進(jìn)展呈升高趨勢(shì)。生存組T1、T2 和T3 時(shí)EFEMP2 水平均高于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 兩組EFEMP2 的蛋白質(zhì)免疫印跡圖

表1 兩組EFEMP2 水平比較±s

表1 兩組EFEMP2 水平比較±s

分組例數(shù)T0T1T2T3生存組 51 0.13±0.030.35±0.060.59±0.09 0.75±0.10死亡組 101 0.13±0.030.31±0.040.46±0.08 0.57±0.08 t 值0.5814.4019.57112.014 P 值0.562＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的效能

T0-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.524（95%CI：0.425～0.622）、0.08、99.01%和11.76%；T1-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC AUC、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.697（95%CI：0.601～0.793）、0.33、79.21%和54.90%；T2-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC AUC、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.876（95%CI：0.814～0.939）、0.51、78.22%和84.31%；T3-EFEMP2診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC AUC、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.922（95%CI：0.881～0.964）、0.60、72.30%和92.20%。T3-EFEMP2診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的效能高于T0-EFEMP2 和T1-EFEMP2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=7.549、4.187，P＜0.001）。見圖2。

圖2 EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC 曲線

2.3 兩組基線資料比較

以T3-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)將其分為兩組：高EFEMP2 組（n=61）和低EFEMP2 組（n=91）。兩組的年齡、性別、病灶位置、轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)、Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤直徑、AFP 和靶向治療方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組基線資料比較

2.4 兩組生存情況比較

高EFEMP2 組中位生存時(shí)間為36 個(gè)月，高于低EFEMP2 組（16 個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank χ2=66.064，P＜0.001）。見圖3。

圖3 兩組生存曲線

2.5 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的Cox 回歸分析

將結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者3年生存預(yù)后作為因變量，將年齡、性別、原發(fā)病灶位置、轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)、Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤直徑、AFP、靶向治療和T3-EFEMP2 作為自變量，分別納入Cox 單因素分析，結(jié)果顯示靶向治療和T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。將結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者3年生存預(yù)后作為因變量，按P＜0.1 的標(biāo)準(zhǔn)將Child-Pugh 分級(jí)、靶向治療和T3-EFEMP2作為自變量，納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示靶向治療和T3-EFEMP2 均是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的Cox 回歸分析

2.6 T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后的關(guān)系

用限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后的關(guān)系，當(dāng)節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為4 時(shí)，AIC 值最?。ˋIC=854.907），此時(shí)結(jié)果顯示T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后有關(guān)（χ2=49.2，P＜0.001），呈非線性關(guān)系（χ2=6.0，P=0.0499）。以T3-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)做為參考點(diǎn)，當(dāng)T3-EFEMP2＜0.60 時(shí)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加；當(dāng)T3-EFEMP2＞0.60 時(shí)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)降低。見圖4。

圖4 T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后的限制性立方樣條圖

3 討論

有極性的上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化成有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程即為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促使細(xì)胞的遷移和侵襲，降低放、化療療效［14-15］。Kang 等［8］研究證實(shí)，EFEMP2 高表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等。Zhou 等［9］研究證實(shí)EFEMP2 可調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Song 等［10］研究證實(shí)上調(diào)EFEMP2 水平可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前，陳勇［16］研究證實(shí)EFEMP2 在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶中低表達(dá)，但關(guān)于其與TACE 治療療效的關(guān)系鮮見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示生存組和死亡組EFEMP2 水平均隨時(shí)間進(jìn)展呈升高趨勢(shì)，此外，生存組T1、T2和T3 時(shí)EFEMP2 水平均高于死亡組，上述結(jié)果表明EFEMP2 水平可能與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平或可評(píng)價(jià)患者預(yù)后。遂構(gòu)建了EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示T3-EFEMP2 診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的ROCAUC、靈敏度和特異度分別為0.922、72.30%和92.20%，其診斷效能高于T0-EFEMP2 和T1-EFEMP2，上述結(jié)果表明T3-EFEMP2 評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的效能高，但靈敏度偏低，可輔助評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后。

本研究進(jìn)一步探究了EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示高EFEMP2組中位生存時(shí)間高于低EFEMP2 組，表明EFEMP2與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療后的生存時(shí)間有關(guān)，可用于預(yù)后評(píng)估。葉濤等［17］研究證實(shí)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的女性患者預(yù)后較男性患者好。魯全芝［18］研究表明肝轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為避免混雜因素影響分析結(jié)果，本研究用Cox 回歸分析影響結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后的因素，結(jié)果顯示靶向治療和T3-EFEMP2均是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，而性別、肝轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目均與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后無(wú)關(guān)，與上述研究結(jié)果存在出入，推測(cè)其差異可能與納入研究樣本量、隨訪時(shí)間及納排標(biāo)準(zhǔn)等有關(guān)，后續(xù)還需開展大樣本、多中心研究驗(yàn)證本研究結(jié)論。

人體EFEMP2 基因位于染色體11q13，該區(qū)域的易位、重排及擴(kuò)增等均與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［19］?，F(xiàn)有研究已表明EFEMP2 可調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路參與多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［8-9］。本研究推測(cè)EFEMP2 可能通過(guò)上述調(diào)節(jié)機(jī)制參與了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而影響了TACE 治療療效。受化療藥物影響，若癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力降低，EFEMP2 水平高；反之，EFEMP2 水平低。因此，檢測(cè)其水平可反映結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療預(yù)后，是以T3-EFEMP2 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年生存預(yù)后有關(guān)，當(dāng)T3-EFEMP2＜0.60 時(shí)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加；當(dāng)T3-EFEMP2＞0.60 時(shí)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移TACE 治療3年預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)降低。

綜上所述，直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中EFEMP2 水平與TACE 治療療效有關(guān)，其水平低提示TACE 治療臨床獲益較小。本研究樣本量較小、隨訪時(shí)間偏短，且檢測(cè)EFEMP2 水平的時(shí)點(diǎn)偏少，下一步將開展大樣本、多中心研究，增加檢測(cè)EFEMP2 的時(shí)點(diǎn)，完善本研究?jī)?nèi)容。