苗周迪,陳希文,彭政,冒鑫哲,堵國成,張娟

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫,214122) 4(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

角蛋白是一種結構穩(wěn)定、不溶于水的蛋白質(zhì),主要存在于羽毛、羊毛、毛發(fā)、蹄和指甲中[1]。全世界每年會產(chǎn)生大量的角蛋白廢棄物,比如羽毛廢棄物和劣質(zhì)羊毛[2]。這些富含角蛋白的廢棄物能夠轉化成為其他增值產(chǎn)品,如飼料和肥料[3]。目前物理法和化學法處理是提取的主要策略,這些策略常常涉及到高溫或強酸強堿的使用,不僅會造成空氣、土壤和水的污染,也會降低角蛋白分解產(chǎn)物的價值[4]。由真菌、放線菌等多種微生物產(chǎn)生的角蛋白酶能有效地水解角蛋白廢棄物,是一種有效的替代方法[5]。角蛋白酶因其寬泛的底物專一性以及較強的水解能力,廣泛地運用于飼料[6]、制革[7]、化妝品[8]、醫(yī)藥[9]等領域。

雖然角蛋白酶能夠有效降解角蛋白廢棄物,但是在具體應用場景中的耐受性和穩(wěn)定性仍然受到挑戰(zhàn)[10]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn),角蛋白酶KerZ1的最適反應溫度為60 ℃,并在此溫度下對羽毛角蛋白廢物有著高效的水解作用。但是,KerZ1在60 ℃下的半衰期僅為18 min,這對于整個催化過程顯然是不利的[11]。由于較高的反應溫度不僅能夠提高催化反應速率并且能夠降低微生物污染的風險[12],因此,提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性將可以有效提升其在實際應用中的價值。

目前,蛋白質(zhì)工程是提高生物催化劑熱穩(wěn)定性的有效手段,主要分為定向進化與理性設計兩類[13]。定向進化是一種較為普遍的策略,因為其對蛋白質(zhì)的相關信息需求較小,但是該策略需要消耗大量的時間和資源進行突變文庫的篩選和數(shù)據(jù)分析[14]。而理性設計以蛋白質(zhì)的結構信息為基礎,通過計算機分析出可能會提高熱穩(wěn)定性的氨基酸相互作用,然后利用定點突變手段引入突變位點并驗證效果[15]。與定向進化相比,理性設計可以有效減少突變庫的大小,增加定向進化的效率,是一種可行性較高的策略。

蛋白質(zhì)結構中的柔性環(huán)區(qū)域loop是提高其穩(wěn)定性的潛在目標。Loop是一類多樣化的二級結構,包括轉角、無規(guī)則卷曲以及其他連接二級結構的氨基酸鏈[16]。大量的研究結果表明,loop在調(diào)節(jié)酶的催化作用[17],穩(wěn)定性[18]以及底物特異性[19]方面發(fā)揮著重要作用。因此,預測出蛋白質(zhì)結構中的柔性區(qū)域,剛化該柔性區(qū)域可以進一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。B-factor分析和分子動力學模擬是兩種常用的研究蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的方法。B-factor是從X光衍射晶體結構中獲得的,可以有效反映氨基酸殘基的靈活性,但是它依賴于晶體結構的分辨率,不同分辨率的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)會影響對氨基酸靈活性的預測[20]。分子動力學模擬主要是在原子水平上模擬蛋白質(zhì)在某個時間段的運動軌跡,并可以準確提供蛋白質(zhì)在其生理環(huán)境中的靈活性。與B-factor分析相比,分子動力學模擬需要消耗大量的計算資源,對計算機的運算能力也有較高的要求。目前,已經(jīng)有各種方法改造柔性區(qū)域從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,比如添加鹽橋[21],引入二硫鍵或脯氨酸[22]以及迭代飽和突變[23]等。

基于同源性分析的方法已經(jīng)被廣泛應用于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。一種相對典型的方法就是將目標蛋白酶的序列或結構與嗜熱蛋白酶進行比較,確定突變的關鍵位點。β-轉角是最小的二級結構,由4個殘基(位置i,i+1,i+2,i+3)組成,通常分布在柔性區(qū)域中[24]。對構成426條蛋白質(zhì)鏈的7 153個β-轉角殘基的統(tǒng)計分析表明,在特定的β-轉角上,某些氨基酸的出現(xiàn)頻率會高于其他氨基酸[24],所以將不同位置上的氨基酸替換為頻率更高的氨基酸就有可能提高目標蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。基于這些假設,我們通過在柔性區(qū)域中的β-轉角引入氨基酸突變以提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,獲得了熱穩(wěn)定提高的角蛋白酶,拓寬了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600及質(zhì)粒pP43 NMK均由本實驗室保藏。

1.1.2 主要實驗試劑

PrimeSTAR?Max DNA Polymerase,大連寶生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶DpnI,Thermo-Fisher Scientific公司;Bradford試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;HisTrapTMHP預裝柱,GE Healthcare公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 PCR引物設計

本研究中PCR擴增所用引物通過上海生工生物工程股份有限公司來合成,引物見表1。

1.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5、蛋白胨 10、NaCl 10,固體培養(yǎng)基則加20 g/L的瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min。根據(jù)實際需要添加相應的抗生素。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used for PCR in this study

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 20、酵母粉 10、蛋白胨 20、Na2HPO4·12H2O 6、KH2PO43、MgSO4·7H2O 0.3,121 ℃滅菌15 min?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵使用。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度37 ℃,旋轉式搖床220 r/min。

1.2 突變體酶的構建

利用Quick ChangeTM定點突變的方法構建突變體角蛋白酶[25]。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)過DpnI酶切處理后,轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞,轉化產(chǎn)物涂布于LB平板上(100 μg/mL氨芐青霉素),于37 ℃過夜培養(yǎng)。從LB平板上挑取陽性轉化子,提取質(zhì)粒之后送上海生工進行測序驗證。將測序正確的重組質(zhì)粒轉化表達載體B.subtilisWB600,轉化產(chǎn)物涂布于LB平板上(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃過夜培養(yǎng)。得到的轉化子即為目標角蛋白酶重組菌。

1.3 突變體酶的表達及純化

挑取B.subtilisWB600轉化子轉接至2 mL LB培養(yǎng)基中(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃、220 r/min搖床過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的種子液按體積分數(shù)2%轉接至25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵獲得的菌液于4 ℃、7 000 r/min離心10 min,得到粗酶液。利用鎳離子親和色譜柱純化蛋白質(zhì)。用20 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液平衡預裝柱,將處理后的粗酶液上樣,然后用含有50 mmol/L咪唑的20 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫得到純酶。利用SDS-PAGE和Bradford試劑盒檢測蛋白的純度和濃度。

1.4 角蛋白酶酶活力的測定

取50 μL適當稀釋的酶液,加入150 μL 50 mmol/L的Gly-NaOH溶液(pH 10)作為緩沖液和100 μL 25 g/L的水溶性角蛋白作為底物,混勻后于60 ℃下反應20 min;加入200 μL 0.5 mol/L的三氯乙酸終止反應,室溫12 000 r/min離心2 min。取上清液200 μL,加入1 mL 50 g/L的Na2CO3溶液和200 μL的福林酚試劑,混勻后于50 ℃下顯色10 min,使用分光光度計測定波長660 nm下的吸光度;空白對照是在加入底物之前先加入反應終止劑三氯乙酸,其余操作同上。

酶活力單位定義:一個活力單位(U)為吸光度在波長660 nm下每分鐘升高0.001[11]。

1.5 酶的熱穩(wěn)定性研究

半衰期(t1/2)測定:將純化后的KerZ1及其突變體酶置于60 ℃水浴中,每隔10 min取樣并測定殘余酶活力。以水浴處理前酶活力為100%,以后每次取樣酶活力為相對酶活力。作以殘余酶活力的ln值為縱坐標,時間t為橫坐標的散點圖,通過對數(shù)據(jù)點的線性擬合獲得角蛋白酶失活速率常數(shù)k,然后帶入公式:t1/2=ln2/k計算半衰期[26]。

半失活溫度(T50)測定:將純化后的KerZ1及其突變體酶置于不同的溫度下(30～80 ℃)水浴處理20 min,測定其殘余酶活力。以各自最高酶活力為100%,其余溫度下酶活力為相對酶活力。以相對酶活力為縱坐標,溫度為橫坐標作圖,計算半失活溫度。

1.6 動力學參數(shù)研究

將角蛋白底物按照體積分數(shù)稀釋(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%),參照酶活力測定方法測定不同底物濃度下的反應初速,計算米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax),并進一步計算催化常數(shù)kcat以及催化效率kcat/Km。

1.7 分子動力學模擬

角蛋白酶KerZ1與模板greglin以及subtilisin的復合蛋白體KerA(PDB 4 gi3,1.75 ? resolution)的成熟酶氨基酸序列具有99%的同源性,通過在線模擬服務器SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive),以PDB數(shù)據(jù)庫中KerA的晶體結構為模板,同源模擬角蛋白酶KerZ1及其突變體酶的晶體結構。使用AMBER16進行分子動力學模擬,力場選定ff14SB[27],以水分子盒子包裹同源建模模型,并設定盒子邊界與蛋白質(zhì)表面的最小距離為12 ?,在溶劑中添加150 mmol/L的NaCl以平衡系統(tǒng)的正負電荷,整個分子動力學模擬包括水平衡、側鏈平衡、能量最小化、50 ps的0～300 K的升溫過程和20 ns的動力學模擬。利用AMBER16自帶的分析工具計算每個氨基酸殘基的均方根浮動(root mean square fluctuation,RMSF)。

2 結果與分析

2.1 角蛋白酶柔性環(huán)區(qū)域的改造

利用PyMOL軟件對KerZ1(PDB 4 gi3)中的二級結構進行標注,一共確定了15個loop環(huán)區(qū)域。通過將KerZ1的PDB文件提交至在線服務器HotSpot Wizard 3.0(http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspot-wizard)中計算每個氨基酸殘基的B-factor值[28]。B-factor主要反映原子構象狀態(tài)的一種“模糊度”,其值越高,模糊度越大,對應結構構象越不穩(wěn)定。每個loop環(huán)區(qū)域的B-factor通過環(huán)路內(nèi)每個氨基酸殘基的平均B-factor計算得到,KerZ1的15個loop環(huán)區(qū)域及其B-factor值計算結果見表2。

表2 基于B-factor值的Loop環(huán)靈活性等級表Table 2 Flexibility rank of loops based on B-factors

各loop環(huán)區(qū)域的B-factor值比較結果如圖1所示。Loop8 127～130和Loop13 238～240表現(xiàn)出最高的靈活性。Loop9 152～173由22個氨基酸殘基組成,是角蛋白酶結構中最長的環(huán)區(qū)域,也表現(xiàn)出較高的靈活性。

圖1 角蛋白酶KerZ1中l(wèi)oop環(huán)區(qū)域的B-factor值比較Fig.1 Comparison of B-factor of loops in KerZ1

分子動力學模擬也被用于分析KerZ1結構的靈活性。在300 K下,對KerZ1的結構進行了20 ns的分子動力學模擬,并計算每個氨基酸殘基的RMSF值,結果如圖2所示。RMSF值反映了構象的靈活度,其值越高,對應的結構柔性越大。結果表明,RMSF值雖然從不同的角度反映構象的靈活度,但是總體的結果與B-factor分析的結果一致,說明兩者在預測蛋白質(zhì)柔性區(qū)域方面具有相似性。盡管相關性很強,但是結果中也存在一定差異。例如,根據(jù)在300 K下分子動力學模擬計算的RMSF值,KerZ1最靈活的3個環(huán)區(qū)域是loop8、loop9以及l(fā)oop5,而B-factor分析下最靈活的3個區(qū)域是loop8、loop13以及l(fā)oop9。因此,結合B-factor分析與分子動力學模擬,最終確定KerZ1的2個柔性環(huán)區(qū)域作為改造對象,分別是loop8 127～130和loop9 152～173。

圖2 在300 K下角蛋白酶KerZ1氨基酸殘基的RMSF值Fig.2 Normalized RMSF values of KerZ1 amino acid residues at 300 K

同源性分析最典型的例子是將目標蛋白酶的序列或結構與嗜熱蛋白酶進行比對,確定突變的關鍵位點。YU等[29]基于同源性分析對大腸桿菌轉酮酶柔性區(qū)域的β-轉角進行了改造,提高了熱穩(wěn)定性。通過對β-轉角殘基的統(tǒng)計分析,不同類型β-轉角上的部分氨基酸頻率會高于其它氨基酸。例如,在Ⅱ型β-轉角的i位置上,半胱氨酸與脯氨酸的出現(xiàn)頻率最高,如果Ⅱ型β-轉角的i位置的氨基酸不是半胱氨酸或脯氨酸,將其突變?yōu)槠渲幸环N就有可能提高目標蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。因此,基于這些假設,我們從PDBsum數(shù)據(jù)庫中獲得了角蛋白酶3個柔性環(huán)區(qū)域內(nèi)的β-轉角信息,設計引入了13個單點突變體,設計結果如表3所示。

表3 基于β-轉角氨基酸位置偏好的突變體設計Table 3 Design of variants based on β-turn amino acid positional preference.

2.2 角蛋白酶及其突變體酶的表達與純化

利用Quick ChangeTM將表3確定的氨基酸殘基引入KerZ1,構建的重組質(zhì)粒轉化B.subtilisWB600中進行突變體酶的表達。為了初步確定突變體酶的熱穩(wěn)定性,測定了KerZ1及突變體酶粗酶液在60 ℃水浴處理1 h條件下的殘余酶活力,結果如圖3所示,突變體酶A128D表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性,其殘余酶活力高于KerZ1,而其他突變體酶的殘余酶活力均低于KerZ1。通過鎳親和色譜柱進一步純化KerZ1與A128D,并進行SDS-PAGE分析,KerZ1與A128D的分子質(zhì)量約為30 kDa(圖4)。

圖3 KerZ1及其突變體酶在60 ℃下處理1 h的殘余酶活力Fig.3 Residual enzyme activity of KerZ1 and its mutants at 60 ℃ for 1 h

M-蛋白marker;泳道1-KerZ1;泳道2-A128D圖4 KerZ1和A128D的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of KerZ1 and A128D

2.3 角蛋白酶熱穩(wěn)定性測定

將純化后的KerZ1和A128D置于不同溫度下(30～80 ℃)水浴處理20 min研究其溫度適應性。如圖5-a所示,KerZ1和A128D在50～80 ℃明顯下降。KerZ1在60和80 ℃水浴處理時分別損失了48%和100%的酶活性,A128D表現(xiàn)出比KerZ1更好的熱穩(wěn)定性,A128D的熱失活溫度(T50)為67.4 ℃,與KerZ1的熱失活溫度61.6 ℃相比有所提高?？紤]到60 ℃是KerZ1的最佳酶活性溫度,且在該溫度下酶活力下降明顯,因此選擇60 ℃條件進一步驗證其熱穩(wěn)定性的提高。

a-不同溫度下的熱穩(wěn)定性;b-60 ℃下的半衰期圖5 KerZ1和A128D的熱穩(wěn)定性及半衰期測定Fig.5 Determination of thermostability and half-life of KerZ1 and A128D

將KerZ1和A128D置于60 ℃水浴中處理1 h,每隔10 min取樣測其殘余酶活力并計算60 ℃條件下的半衰期(t1/2),結果如圖5-b所示,A128D的半衰期(t1/2)為30.44 min,是KerZ1半衰期(18.12 min)的1.68倍。綜上所述,在KerZ1的β-轉角中引入的突變D128有效提高了角蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

2.4 角蛋白酶的動力學參數(shù)

以不同濃度的角蛋白為底物測量KerZ1和A128D在60 ℃下的酶活性和動力學參數(shù),結果如表4所示,A128D的Km值低于KerZ1,表明A128D對底物的親和力有所提升。而在催化效率方面,A128D的kcat/Km與KerZ1相比提高了6.29%,表明催化效率有所提高。因此,A128D在熱穩(wěn)定性提升的同時在動力學方面的表現(xiàn)也優(yōu)于KerZ1。

表4 KerZ1和A128D的酶動力學參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of KerZ1 and A128D

2.5 突變體酶的穩(wěn)定性機制分析

分子動力學模擬計算得到的RMSF值揭示了其熱穩(wěn)定性提高的機制。如圖6所示,引入的突變D128與A128相比有更低的RMSF值,整個loop8區(qū)域的氨基酸殘基的RMSF都明顯降低,這說明A128D的loop8的結構變得更加穩(wěn)定,從而提高了KerZ1的熱穩(wěn)定性。通過突變體A128D的三維結構進一步分析了KerZ1熱穩(wěn)定性提高的機制。

圖6 KerZ1和A128D殘基靈活性比較Fig.6 The residual flexibility of KerZ1 and A128D

如圖7-a所示,A128所在的loop8位于蛋白質(zhì)結構表面,但是其周圍的氨基酸G126、G127、S129、G130以及S131都是親水性氨基酸。因此,作為一種疏水性氨基酸,A128可能破壞了loop8結構的穩(wěn)定性,從而導致KerZ1穩(wěn)定性的下降。通過降低蛋白質(zhì)表面的疏水性提高其熱穩(wěn)定性已經(jīng)在黃素氧化還原蛋白的研究中得到了證實[30]。在本研究中,當A128突變?yōu)镈后,作為一種親水性氨基酸,D128與周圍親水性氨基酸提高了蛋白質(zhì)表面的親水性,這可能使loop8變得更加穩(wěn)定(圖7-b)。因此,A128D表面親水性的增加可能是其熱穩(wěn)定性提高的主要原因之一。

圖7 KerZ1 (a)和A128D (b)三維結構以及突變殘基位置的示意圖Fig.7 Schematic diagram of the three-dimensional structure and mutant residue positions of KerZ1 (a) and A128D (b)

3 結論

角蛋白酶KerZ1在其最適反應溫度60 ℃下的熱穩(wěn)定性較差,這限制其實際應用的潛力。通過B-factor分析和分子動力學模擬對角蛋白酶KerZ1中的柔性環(huán)區(qū)域進行了不穩(wěn)定性預測,并基于β-轉角的統(tǒng)計學分析結果在柔性環(huán)區(qū)域的β-轉角中引入了氨基酸突變,獲得一個熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體酶A128D。進一步,基于分子動力學模擬分析了突變體熱穩(wěn)定性提高的機制,結果表明,與KerZ1相比,A128D在柔性環(huán)loop8這一區(qū)域中表現(xiàn)出了更低的RMSF值。通過三維結構分析突變位點殘基以及周圍氨基酸殘基的分布,發(fā)現(xiàn)引入的D128為親水性更好的氨基酸,與周圍的親水性氨基酸一起增加了蛋白質(zhì)表面的親水性,從而提高了熱穩(wěn)定性。總之,本研究首次對角蛋白酶中的β-轉角進行了改造,有效地提高了角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,也為其他工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性改造提供了思路。