李思，田思雨，袁宏

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧大連116011；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044；3.大連市中心醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116089)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)作為目前世界上第三位常見癌癥，每年全球范圍內(nèi)約有140萬例新增病例以及超過60萬的死亡病例[1]。目前，奧沙利鉑與5-氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸(FOLFOX)聯(lián)合化療方案在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的緩解率僅為50%[2]。化療患者發(fā)生轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療耐藥性仍然是結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵障礙。研究表明，LncRNA在癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，多種異常表達(dá)的LncRNA可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要功能[3]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA表達(dá)失調(diào)與結(jié)直腸癌的化學(xué)耐藥有關(guān)[4]。目前研究表明，LncRNA主要通過多種機(jī)制介導(dǎo)癌癥耐藥，包括限制藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累[5]，增加DNA損傷修復(fù)[6]等。LncRNA PiHL是定位于核內(nèi)的LncRNA，在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且PiHL的表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤體積和患者預(yù)后相關(guān)。但是PiHL在結(jié)直腸癌耐藥中的具體功能和作用機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步明確PiHL在結(jié)直腸癌化療耐藥中的關(guān)鍵作用，本課題組構(gòu)建了結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系，確定了PiHL在耐藥細(xì)胞系中呈高表達(dá)；通過體外生物學(xué)實驗證實結(jié)直腸癌細(xì)胞中PiHL的表達(dá)水平對奧沙利鉑作用的影響；并探討PiHL通過與多梳抑制復(fù)合物結(jié)合介導(dǎo)奧沙利鉑的耐藥，初步闡明其機(jī)理。報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、試劑與儀器 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620、SW480、DLD1、HCT116和人胚腎上皮細(xì)胞HEK293T均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，引物均購自大連寶生物公司，奧沙利鉑(美國MCE公司)，慢病毒(上海杰李公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa公司)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox，瑞士Roche公司)，RNAmax T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州銳博生物公司)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermo Fisher公司)。Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)，水平電泳儀(上海天能科技公司)，流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)，NanoDrop微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2細(xì)胞毒性實驗 取對數(shù)生長期的上述細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1 000個/孔)，第2天加入含奧沙利鉑培養(yǎng)基處理，分別設(shè)置對照組(加入0.5%DMSO)、空白組(無細(xì)胞)及加藥組(不同細(xì)胞的加藥濃度不同，根據(jù)細(xì)胞的IC50確定)。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，加入不含血清培養(yǎng)基的CCK8試劑(每孔100 μL，1∶10稀釋)，37 ℃培養(yǎng)箱溫育1～2 h，于450 nm波長下檢測吸光度A值，并計算各組存活率。

1.3奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系的構(gòu)建 取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、DLD1、SW480、SW620，用含(初濃度為0.1 μmol/L)奧沙利鉑的DMEM培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞能維持正常生長且存活率大于50%時，根據(jù)不同細(xì)胞的存活狀況提高藥物濃度，反復(fù)誘導(dǎo)，直至細(xì)胞能夠在含一定濃度的奧沙利鉑和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中正常生長，細(xì)胞存活率與正常細(xì)胞無顯著差異。

1.4構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)PiHL結(jié)直腸癌細(xì)胞系和穩(wěn)定干擾PiHL結(jié)直腸癌細(xì)胞系 構(gòu)建PiHL過表達(dá)質(zhì)粒和包含PiHL靶向序列的shRNA，按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書配制病毒包裝體系(即病毒包裝)。向含待轉(zhuǎn)染且處于對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1.5 mL新培養(yǎng)基及500 μL病毒液(室溫融化)，加入2 μL polybrene轉(zhuǎn)染試劑，培養(yǎng)48 h后用 0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選并繼續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期且未經(jīng)處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞(對照組)和干擾PIHL表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞(實驗組)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，第2天更換新的培養(yǎng)液并加入奧沙利鉑作用24 h，使用無EDTA的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并用PBS洗滌；加入緩沖液、Annexin V以及FITC PI染液，室溫避光溫育15 min；設(shè)置未染色、Annexin V單染、PI單染作為空白對照。采用流式細(xì)胞儀檢測，計數(shù)20 000個細(xì)胞，使用Flowjo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 收集上述對數(shù)生長期細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存，提取的RNA/DNA使用Nandrop2000微量分光光度計測定濃度和純度，選取吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0之間的樣本用于后續(xù)實驗。PCR總反應(yīng)體積為 20 μL，包括：TBGreenPremix Ex TaqⅡ(2×)10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6.4 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s,共40個循環(huán)。在56 ℃時收集每個循環(huán)的熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。采用儀器自帶軟件分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線中的熒光信號，并計算平均閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)。以β-actin作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達(dá)量。

1.7western blot檢測PiHL過表達(dá)和干擾后EZH2的表達(dá)變化 使用慢病毒作為載體,構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)PiHL的DLD1、HCT116細(xì)胞及其陰性對照(NC組)，穩(wěn)定干擾PiHL的DLD1-oxa、HCT116-oxa細(xì)胞及其陰性對照組。將細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%、單孔細(xì)胞總數(shù)不少于106個時，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌并用RIPA緩沖液裂解。使用BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)水平，用含10% SDS的PAGE電泳分離總蛋白質(zhì)，使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀調(diào)節(jié)穩(wěn)定電流為300 mA，根據(jù)所要檢測蛋白質(zhì)分子量大小設(shè)置轉(zhuǎn)膜時間。用含5%BSA的TBST封閉PVDF膜，室溫?fù)u床振蕩溫育2 h。再次用TBST充分洗滌后，加入兔抗anti-EZH2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃搖床溫育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體anti-IgG(1∶1 000稀釋)室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2 h。使用ECL顯色試劑在避光環(huán)境中顯影，掃描成像后采用Image J軟件對目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8RNA pull-down試驗檢測PiHL與EZH2蛋白的結(jié)合 利用T7 RNA合成酶識別序列合成引物，以cDNA為模板擴(kuò)增出攜帶T7 RNA合成酶識別序列的PiHL全長DNA產(chǎn)物，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，去除cDNA模板并對產(chǎn)物純化后得到LncRNA PiHL并標(biāo)記上生物素，將PiHL與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞核裂解液反應(yīng)，并用親和素標(biāo)記的磁珠將PiHL結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行純化，用EZH2抗體進(jìn)行western blot。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析，圖表繪制使用Graphpad 8.0軟件；實驗組與對照組差異的比較采用配對t檢驗。Spearman檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PiHL在4種奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 所構(gòu)建的耐藥細(xì)胞系對奧沙利鉑產(chǎn)生顯著穩(wěn)定的耐藥性(圖1)，奧沙利鉑在不同細(xì)胞的IC50值見表1。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測HCT116、DLD1、SW620、SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞和其對應(yīng)耐藥細(xì)胞系中PiHL的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞系PiHL的表達(dá)水平較親本細(xì)胞均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖1 CCK8法檢測結(jié)直腸癌親本和耐藥細(xì)胞系奧沙利鉑敏感性

表1 奧沙利鉑在不同細(xì)胞中的IC50值(μmol/L)

注：與對照組相比，**，P<0.01。

2.2PiHL促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥 CCK8法結(jié)果顯示，在HCT116、DLD1、SW480細(xì)胞中，PiHL基因被穩(wěn)定過表達(dá)后，在相同濃度奧沙利鉑作用下細(xì)胞的存活率均顯著高于對照組(圖3)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，過表達(dá)PiHL組奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例較對照組明顯減少(圖4)，細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性明顯降低。在耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，奧沙利鉑作用下shRNA PiHL1和shRNA PiHL組細(xì)胞存活率明顯低于對照組，并且細(xì)胞凋亡比例明顯增加。見圖5、6。

注：與對照組相比，*，P<0.05。

注：與對照組相比，*，P<0.05。

注：與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

注：與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

2.3PiHL通過與EZH2結(jié)合對CDKN2B/RUNX3/KLF家族基因進(jìn)行表觀遺傳抑制 對TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌組織樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),PiHL的表達(dá)和PRC2的組成成分EZH2、SUZ12、EED的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖7)。RNA pull-down試驗和western blot驗證PiHL與多梳抑制復(fù)合物作用的結(jié)果如圖8所示，RNA PiHL可以與EZH2蛋白結(jié)合，且PiHL的反義鏈幾乎不能與EZH2蛋白結(jié)合。此外，western blot檢測PiHL過表達(dá)和干擾后EZH2的表達(dá)變化，結(jié)果顯示在DLD1和HCT116細(xì)胞中，PiHL表達(dá)水平的改變并不直接影響EZH2蛋白的表達(dá)水平(圖9)。為了進(jìn)一步鑒定涉及PiHL參與表觀遺傳調(diào)控過程的基因，利用構(gòu)建的干擾PiHL表達(dá)HCT116細(xì)胞和對照HCT116細(xì)胞進(jìn)行RNA測序，結(jié)果顯示，PiHL敲除后存在大量差異表達(dá)的基因。在火山圖分析中，鑒定出多個與其表達(dá)水平相差2倍以上及P<0.001的基因，其中包括多個重要的PRC2靶基因。在奧沙利鉑耐藥的HCT116、DLD1細(xì)胞中干擾PiHL并使用qRT-PCR進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示在HCT116、DLD1細(xì)胞中干擾PiHL表達(dá)后抑癌基因CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3表達(dá)顯著上調(diào)(圖10)。

圖7 TCGA數(shù)據(jù)庫中PiHL與PRC2組分的相關(guān)性

圖8 RNA pull-down結(jié)合western blot檢測PiHL與EZH2蛋白的結(jié)合

圖9 western blot檢測PiHL對EZH2蛋白的調(diào)控作用

注：A，基因火山圖；B,部分基因熱圖；C、D，qRT-PCR檢測干擾PiHL表達(dá)后細(xì)胞中PRC2靶基因的表達(dá)；與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

3 討論

在本研究中，筆者根據(jù)PiHL在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌腫瘤體積和患者預(yù)后相關(guān)，進(jìn)而提出了PiHL可能參與介導(dǎo)結(jié)直腸癌耐藥的假設(shè)。由于不同細(xì)胞系TP53、KRAS等重要基因的突變背景不同，可能對藥物敏感性產(chǎn)生一定影響，為了進(jìn)一步確定PiHL在細(xì)胞耐藥中的功能，本實驗利用4種結(jié)直腸癌細(xì)胞通過體外持續(xù)誘導(dǎo)的方式構(gòu)建了其對應(yīng)的穩(wěn)定的奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系，并檢測了親本和耐藥細(xì)胞系中PiHL的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PiHL在耐藥細(xì)胞系HCT116-oxa、DLD1-oxa、SW620-oxa、SW480-oxa中的表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞，提示PiHL可能參與了奧沙利鉑的耐藥機(jī)制并對腫瘤耐藥起到促進(jìn)作用。為明確PiHL在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中的功能，筆者進(jìn)一步通過試驗得出穩(wěn)定過表達(dá)PiHL可以增加細(xì)胞在奧沙利鉑處理后的存活率，減少奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；耐藥細(xì)胞敲除PiHL后細(xì)胞存活率明顯低于對照組，藥物誘導(dǎo)的凋亡比例顯著增高，提示PiHL可能保護(hù)結(jié)直腸癌細(xì)胞免受奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡。以上數(shù)據(jù)均進(jìn)一步證實PiHL的表達(dá)水平影響細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，PiHL表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥，PiHL表達(dá)缺失則對細(xì)胞耐藥起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

近年來，LncRNA被認(rèn)為是PRC2功能的重要參與者，細(xì)胞核內(nèi)LncRNA通過與PRC2結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[7]。筆者對TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌組織樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PiHL表達(dá)和PRC2的組成成分EZH2、SUZ12、EED的表達(dá)存在顯著正相關(guān)。qRT-PCR分析結(jié)直腸癌組織樣本中的基因表達(dá)情況也證實癌組織中PiHL的表達(dá)水平與EZH2呈正相關(guān)，提示PiHL可能參與PRC2介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。為了驗證假設(shè)，筆者在HCT116細(xì)胞中使用EZH2抗體進(jìn)行RNA pull-down及western blot，結(jié)果顯示體外轉(zhuǎn)錄的LncRNA PiHL可以與細(xì)胞中的EZH2蛋白直接結(jié)合。同時，western blot結(jié)果顯示,PiHL并不直接調(diào)控EZH2蛋白的表達(dá)，表明PiHL通過與EZH2結(jié)合參與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。為了進(jìn)一步鑒定涉及PiHL參與表觀遺傳調(diào)控過程的基因，筆者對干擾PiHL表達(dá)的HCT116細(xì)胞和對照HCT116細(xì)胞進(jìn)行RNA測序分析，結(jié)果顯示PiHL敲除后存在大量差異表達(dá)的基因，這些變化的基因中包括多個重要的PRC2靶基因。研究報道，多個腫瘤抑制基因如KLF2、RUNX3、CDH1、CDKN1C、CDKN2B、P14和P16等參與PRC2介導(dǎo)的癌癥進(jìn)展[8-10]。筆者通過閱讀文獻(xiàn)和qRT-PCR進(jìn)一步篩選和驗證，結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，PiHL表達(dá)下調(diào)顯著增加了CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3等基因的表達(dá)。結(jié)合上述文獻(xiàn)結(jié)果，證實了結(jié)直腸癌細(xì)胞中PiHL的表達(dá)水平與對奧沙利鉑的敏感性有關(guān)，PiHL的高表達(dá)可以抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥。PiHL通過與多梳抑制復(fù)合物中EZH2蛋白結(jié)合表觀遺傳沉默重要的抑癌基因CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3的表達(dá)，可能是結(jié)直腸癌細(xì)胞中奧沙利鉑耐藥的重要機(jī)制。在將來的研究中，筆者將通過回顧性實驗進(jìn)一步證實EZH2對這些抑癌基因的調(diào)控關(guān)系，并且在臨床樣本中探討LncRNA PiHL的應(yīng)用價值。