廖昕萌，潘煒倫，馮俊杰，李博

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廣州 510515)

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的膜性囊泡，依據(jù)粒徑和來(lái)源可將其分為：外泌體、微囊泡和凋亡小體[1]。EVs內(nèi)含有多種生物分子，可參與細(xì)胞間信息交流，并反映疾病狀況以輔助臨床診斷和治療[2]。EVs廣泛分布于血漿、尿液、腦脊液等各類體液[3]，其中血漿標(biāo)本因具有采集、處理和保存的方法成熟、取材方便、EVs含量豐富(108～1013顆粒/mL)[3]、不同生理和病理?xiàng)l件下EVs數(shù)量及其內(nèi)容物含量差異大等特點(diǎn)，故而血漿EVs在疾病的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中具有極大優(yōu)勢(shì)，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。但血漿EVs的傳統(tǒng)分離方法受到多種血漿成分的干擾，難以實(shí)現(xiàn)EVs的高效分離，因此，近年來(lái)發(fā)展了許多新型分離方法以應(yīng)對(duì)傳統(tǒng)血漿EVs分離遇到的難題。本文將分析傳統(tǒng)血漿EVs分離和鑒定方法，并重點(diǎn)從新型親和法、微流控法和聯(lián)合應(yīng)用法3個(gè)方面介紹新型分離方法的研究進(jìn)展，以期為血漿EVs分離方法的發(fā)展提供參考和借鑒。

1 傳統(tǒng)的血漿EVs分離和鑒定方法

傳統(tǒng)的血漿EVs分離方法包括超速離心法(ultracentrifuge, UC)、超濾法(ultrafiltration, UF)、沉淀法(precipitation)、色譜法(size exclusion chromatography, SEC)和免疫親和法(immunoaffinity)等(表1)。由于受到血漿中多種復(fù)雜成分的干擾，使用傳統(tǒng)方法分離血漿EVs存在分離效率低、純度低、特異性低、EVs受損變性或生物活性低等缺陷，因此，分離后常需使用多種鑒定方法從不同維度驗(yàn)證分離產(chǎn)物(表2)。

表1 常用的傳統(tǒng)血漿EVs分離方法

表2 常用的血漿EVs鑒定方法

2 新型血漿EVs分離方法

如今許多新型血漿EVs分離方法能克服傳統(tǒng)分離方法的缺陷，實(shí)現(xiàn)血漿EVs快速分離，并提高產(chǎn)率、純度和特異性，滿足多種應(yīng)用的需求。常見的新型血漿EVs分離方法包括：(1)新型親和法；(2)微流控法；(3)聯(lián)合應(yīng)用法。

2.1新型親和法 親和法因高度特異性而被廣泛用于血漿EVs的分離，利于不同疾病的深入研究(表3)。除了免疫親和法外，脂質(zhì)親和法和二氧化鈦(TiO2)親和法也是近年來(lái)血漿EVs分離的新策略。此外，親和法中的配體也可以是適配體、多肽類、跨膜蛋白和肝素。

表3 新型親和法在血漿EVs分離中的應(yīng)用

然而，所有親和法都存在一定局限性：(1)截至目前，沒(méi)有研究發(fā)現(xiàn)存在于所有EVs的通用型表面標(biāo)志物，因此，表面標(biāo)志物的數(shù)量和表達(dá)量會(huì)影響分離產(chǎn)率，使得產(chǎn)率小于實(shí)際樣本中的EVs數(shù)量，導(dǎo)致EVs所含的重要信息在后續(xù)檢測(cè)中被遺漏；(2)許多疾病的特異性表面生物學(xué)標(biāo)志物依舊未知，故而無(wú)法通過(guò)親和法進(jìn)行相關(guān)疾病的EVs分離[24]；(3)特異性結(jié)合物會(huì)破壞EVs的生物活性和功能，影響其下游實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和應(yīng)用；(4)血漿中的雜質(zhì)蛋白會(huì)與配體、反應(yīng)板或EVs表面多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致EVs的捕獲率、釋放率和分離純度降低；(5)試劑和材料成本較高，難以在臨床應(yīng)用中推廣和普及。

2.2微流控法 近年來(lái)血漿EVs分離方法發(fā)展的主流趨勢(shì)是建立微流控分離平臺(tái)。這種分離方法通過(guò)結(jié)合聲學(xué)、電泳或電磁場(chǎng)等先進(jìn)技術(shù)，根據(jù)EVs的物理和生化特性實(shí)現(xiàn)高通量的非接觸式分離(表4)。該方法無(wú)需特殊的生物學(xué)標(biāo)志物，產(chǎn)率較高，能保護(hù)EVs的結(jié)構(gòu)、內(nèi)容物和功能不受破壞，實(shí)現(xiàn)分級(jí)分離，是血漿EVs分析實(shí)驗(yàn)前處理的理想方法。同時(shí)，微流控分離法能將血漿EVs的分離、表征和檢測(cè)同時(shí)結(jié)合在單個(gè)裝置上，實(shí)現(xiàn)其研究的集成化和一體化。雖然目前微流控分離法仍缺乏成熟的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，且分離效果易受實(shí)驗(yàn)試劑和外界環(huán)境的影響[25]，但其體積小、分離樣本量下限低、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)使它仍具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

表4 非接觸式微流控平臺(tái)在血漿EVs分離中的應(yīng)用

2.3聯(lián)合應(yīng)用方法 血漿EVs的分離方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，適用于不同的標(biāo)本類型，為了彌補(bǔ)單一方法的局限性，目前許多研究聯(lián)合使用多種分離方法以達(dá)到更優(yōu)的分離效果(表5)。通常情況下，UC、UF作為血漿EVs分離策略的前幾步驟，用于去除血漿中的死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等大顆粒雜質(zhì)，而SEC、沉淀法等則用于后續(xù)EVs的純化分離，如Koh等[32]先用UC濾除血漿中大分子物質(zhì)，再用SEC濾除可溶性蛋白質(zhì)，該聯(lián)合方法的產(chǎn)率、雜質(zhì)蛋白清除率均明顯高于單獨(dú)使用UC或SEC。近年來(lái)，許多研究也將新舊分離方法相結(jié)合，不僅能延續(xù)傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)更快速、精準(zhǔn)的分離，也能讓分離平臺(tái)更加小型化、便攜化，利于分離方法在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。不過(guò)，雖然聯(lián)合應(yīng)用方法能取長(zhǎng)補(bǔ)短，但往往操作步驟繁瑣，分離過(guò)程中EVs的損失較多，分離產(chǎn)率不理想。

表5 聯(lián)合應(yīng)用方法在血漿EVs分離中的應(yīng)用

3 血漿EVs分離面臨的挑戰(zhàn)

截至目前，仍然沒(méi)有一種分離方法能適用于所有血漿EVs的研究目的，也無(wú)法完全去除血漿中干擾物質(zhì)對(duì)EVs分離的影響，分離血漿EVs仍存在許多困難和挑戰(zhàn)。血漿EVs分離過(guò)程中常見的干擾物質(zhì)有血漿蛋白、脂蛋白、游離核酸等生物有機(jī)大分子，而一些細(xì)胞、細(xì)胞碎片和病毒顆粒[39]因形態(tài)和體積與EVs相似，也會(huì)影響UC、UF和SEC等物理分離方法。此外，血漿的粘度、密度和離子強(qiáng)度等環(huán)境因素會(huì)影響部分微流控分離法。這些干擾因素都使得在分離血漿EVs時(shí)需要更謹(jǐn)慎地選擇分離方法。

由于下游研究目的不同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)對(duì)EVs純度、來(lái)源和產(chǎn)量等要求不同，故而樣本類型、采集和前處理方法對(duì)于分離臨床樣本中的血漿EVs也至關(guān)重要。血液中多數(shù)的EVs由血小板釋放產(chǎn)生，血液凝固、采血針孔過(guò)小和反復(fù)凍融操作等都極易誘發(fā)血小板釋放EVs[40]。因此，如果需要研究血小板EVs或下游實(shí)驗(yàn)需要大量囊泡結(jié)構(gòu)，則選用血清樣本進(jìn)行EVs分離會(huì)更高效；而如果要檢測(cè)特定類型的疾病特異性EVs亞群，則推薦選用血漿樣本，以最大程度去除血小板EVs，并避免血小板持續(xù)產(chǎn)生EVs而導(dǎo)致后續(xù)分析出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果[41]，還原樣本中最接近實(shí)際情況的EVs濃度和比例。此外，臨床標(biāo)本采集中使用的抗凝劑也會(huì)影響血漿EVs的分離和鑒定，如肝素能與EVs結(jié)合、促進(jìn)血小板活化及抑制PCR反應(yīng)[42]。雖然國(guó)際血栓和止血協(xié)會(huì)(International Society on Thrombosis and Haemostasis)推薦選用檸檬酸鹽作為血漿EVs研究時(shí)的抗凝劑[43]，但其抑制血小板活化的效果弱于乙二胺四乙酸(EDTA)和ACD抗凝劑[44]。因此，應(yīng)具體根據(jù)下游分析和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的抗凝劑。

4 總結(jié)與展望

血漿EVs 在疾病檢測(cè)、診斷、治療、預(yù)后和藥物傳遞中的應(yīng)用潛力已被許多研究證實(shí)[45]。傳統(tǒng)EVs分離方法已經(jīng)不再能滿足研究的需求，人們對(duì)EVs研究興趣的增長(zhǎng)又促使許多先進(jìn)新型分離方法的誕生。由于各類方法具有不同的分離原理和步驟，為了能更高質(zhì)量地獲得所需的EVs，聯(lián)合應(yīng)用方法已成為許多研究的共同趨勢(shì)。而根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的分離方法，可以大大減少血漿EVs分離過(guò)程中的主要干擾因素，更有效地接駁后續(xù)分析研究和下游應(yīng)用，例如：(1)UC、UF和微流控法的產(chǎn)率較高，適用于血漿EVs需求量大的研究；(2)免疫親和法的產(chǎn)物純度和特異性高，適用于血漿中特定EVs表面標(biāo)志物的研究；(3)SEC、微流控法和免疫親和法的血漿蛋白和脂蛋白清除率高，適用于篩選血漿EVs蛋白標(biāo)志物；(4)微流控法的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、粒徑均一[27]，且產(chǎn)物核酸含量能滿足后續(xù)檢測(cè)的需求[9]，適用于血漿EVs的表征等受物質(zhì)形態(tài)影響較大的研究，也適用于疾病的基因分析，利于疾病早期篩查。而隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷進(jìn)步，血漿EVs分離方法在未來(lái)也會(huì)持續(xù)推陳出新，大力推動(dòng)EVs研究和“液體活檢”的發(fā)展。