連麗麗,郭睿,張?zhí)祢?裴宇梅

(吉林大學第一醫(yī)院a.檢驗科，b.耳鼻咽喉頭頸外科,長春 130021)

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)，簡稱肝癌，是肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞發(fā)生的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、進展快、發(fā)病率和死亡率均非常高。早期診斷是降低死亡率的關(guān)鍵，有利于延長患者生存期，提高治療效果。

血清學標志物在肝癌輔助診斷、預(yù)后判斷以及高危人群篩查中獲得了普遍認可。然而，同時檢測血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)、甲胎蛋白異質(zhì)體比率(AFP-L3%)、異常凝血酶原(DCP)和高爾基體蛋白73(GP73)的報道少見，大樣本量分析亦僅見個案報道[1-4]。本研究回顧性分析了6 202例慢性肝病及肝硬化和肝癌患者上述5項指標變化，比較單項及聯(lián)合檢測診斷肝癌的Logistic回歸、ROC曲線以及陽性率和方法學評價指標。旨在對肝癌的輔助診斷和療效評價提供實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 選取2019年10月至2020年12月于吉林大學第一醫(yī)院住院及門診檢測血清AFP、AFP-L3、AFP-L3、DCP及GP73的6 202例患者作為研究對象。其中男4 480例，女1 722例，年齡(54.78±10.94)歲，所有病例經(jīng)病理學或臨床診斷確診，排除合并其他惡性腫瘤、服用維生素K或者華法林以及血液系統(tǒng)疾患。肝炎、肝硬化、肝癌診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[5]、《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]和《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[7]。根據(jù)肝癌患者經(jīng)過手術(shù)和/或放療、化療后是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移(經(jīng)病理組織學、影像學檢查出現(xiàn)伴有遠處轉(zhuǎn)移、血管侵犯及單純肝內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)，其中血管侵犯指出現(xiàn)門靜脈癌栓或肝靜脈癌栓)分為治療后緩解組和治療后未緩解組。6 202例患者進一步分為3組：(1)慢性肝病及肝硬化組2 073例，其中男1 248例，女825例，年齡(50.27±10.42)歲，臨床診斷包括慢性乙型病毒性肝炎824例、乙肝肝硬化799例、肝血管瘤127例、脂肪肝104例、慢性丙型病毒性肝炎86例、肝囊腫68例、丙肝肝硬化29例、慢性乙型病毒性肝炎合并丙型病毒性肝炎13例、肝內(nèi)膽管結(jié)石9例、自身免疫性肝病5例、肝膿腫5例和肝寄生蟲感染4例；(2)肝癌治療前及治療后未緩解組2 274例，其中男1 817例，女457例，年齡(57.09±10.20)歲，臨床診斷包括乙肝相關(guān)肝癌1 610例、丙肝相關(guān)肝癌276例、酒精性肝癌175 例、基礎(chǔ)肝病原因不明肝癌81例、肝移植狀態(tài)79例；慢性乙型肝炎病毒合并丙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌6例，肝內(nèi)膽管癌21例，肝細胞癌-肝內(nèi)膽管癌混合型10例和脂肪性肝癌16例；(3)肝癌治療后緩解組1 855例，其中男1 415例，女440例，年齡(56.80±10.24)歲，臨床診斷包括乙肝相關(guān)肝癌1 379例、丙肝相關(guān)肝癌238例、肝移植狀態(tài)133例、肝內(nèi)膽管癌48例、脂肪性肝癌18例、基礎(chǔ)肝病原因不明肝癌14例、肝細胞癌-肝內(nèi)膽管癌混合型17例和酒精性肝癌8例。3組性別比較使用卡方檢驗分析(χ2=231.449，P=0.000)，男性比率明顯高于女性；3組年齡比較使用單因素方差分析(F=273.149，P=0.000)，慢性肝病及肝硬化組年齡明顯低于肝癌組；肝癌治療前及治療后未緩解組、肝癌治療后緩解組年齡比較使用SNK-q檢驗(P=0.379)，差異無統(tǒng)計學意義。本研究僅收集和分析數(shù)據(jù)，并不涉及患者的個人信息，經(jīng)吉林大學第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理 按照本科室樣品采集手冊要求，使用分離膠促凝管采集靜息狀態(tài)下受試者靜脈血3 mL，3 500 r/min 離心10 min，分離血清(不含溶血，脂血標本)待測。標本于4 h內(nèi)及時檢測，分離血清后置于2～8 ℃保存不超過12 h。

1.2.2檢測系統(tǒng)及參考區(qū)間 采用磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析法，按照C2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑(北京熱景公司)說明書操作。參考區(qū)間：AFP 0～7 ng/mL，AFP-L3 0～1 ng/mL，AFP-L3% <10%，DCP 0～40 ng/mL，GP73 0～150 ng/mL。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0及MedCalc軟件處理，計量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，2組間比較采用兩獨立樣本的Wilcoxon(Mann-Whitney)秩和檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。繪制并評估單項及聯(lián)合檢測診斷肝癌治療前及治療后未緩解組的ROC曲線；構(gòu)建Logistic回歸預(yù)測模型。Delong檢驗分析ROC曲線診斷效能；Waldχ2檢驗用于判斷自變量與應(yīng)變量的關(guān)聯(lián)程度。分析5項指標單項及聯(lián)合檢測陽性率以及診斷肝癌的方法學評價指標。

2 結(jié)果

2.1各組血清5項指標水平比較 肝癌治療前及治療后未緩解組、肝癌治療后緩解組該5項血清指標與慢性肝病及肝硬化組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。慢性肝病及肝硬化組、肝癌治療后緩解組男、女AFP水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；肝癌治療前及治療后未緩解組、肝癌治療后緩解組男、女DCP水平比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，且均為男性高于女性。見表1。

表1 血清5項指標檢測水平的比較[M(P25,P75)]

2.25項指標單項及聯(lián)合檢測診斷肝癌治療前及治療后未緩解組的診斷效能 以慢性肝病及肝硬化組為對照組，肝癌治療前及治療后未緩解組為疾病組，繪制ROC曲線。應(yīng)用Binary Logistic回歸，以疾病狀態(tài)為應(yīng)變量，檢驗項目為自變量，構(gòu)建Logistic回歸預(yù)測模型，計算新變量(即聯(lián)合檢測的預(yù)測概率)，用預(yù)測概率制作ROC曲線。Delong檢驗結(jié)果表明，單項檢測時AFP的AUCROC(0.914)、AFP-L3和AFP-L3%的敏感性(82.94%)及AFP-L3%的特異性(98.22%)和約登指數(shù)(0.812)均高于其他指標。聯(lián)合檢測時AFP-L3%+DCP+GP73及5項聯(lián)合的AUCROC(0.996)和約登指數(shù)(0.955)、AFP-L3%+DCP和AFP+AFP-L3%+DCP的敏感性(97.67%)及AFP+AFP-L3%的特異性(98.12%)均高于其他指標。見圖1、表2。

表2 5項指標單項及聯(lián)合檢測的ROC曲線診斷效能分析(n=4 347)

注：A,5項指標單項檢測診斷肝癌治療前及治療后未緩解組ROC曲線；B,5項指標聯(lián)合檢測診斷肝癌治療前及治療后未緩解組ROC曲線。

2.3各指標聯(lián)合檢測與肝癌治療前及治療后未緩解組的關(guān)聯(lián)程度 通過Logistic回歸，可以量化各指標對疾病的貢獻。Waldχ2檢驗結(jié)果表明，AFP、AFP-L3、AFP-L3%、DCP和GP73在不同組合中的回歸系數(shù)可反映其對肝癌貢獻大小。OR值反映其與肝癌關(guān)聯(lián)程度。通過Logistic預(yù)測模型，可計算每個樣本聯(lián)合檢測的預(yù)測概率。與臨界值比較，用于判斷在一定預(yù)測正確率下是否患有肝癌。見表3、表4。

表3 各指標聯(lián)合檢測的Logistic回歸模型(n=4 347)

表4 各指標聯(lián)合檢測診斷肝癌治療前及治療后未緩解組的Logistic 回歸分析(n=4 347)

2.45項指標單項及聯(lián)合檢測陽性率和診斷肝癌的方法學評價 慢性肝病及肝硬化組、肝癌治療前及治療后未緩解組AFP陽性率(6.37%、79.77%)和肝癌治療后緩解組DCP陽性率(17.63%)均高于其他單項指標；3組5項聯(lián)合陽性率分別為11.82%、99.82%和32.94%，均高于其他聯(lián)合指標。以疾病診斷為列變量，檢驗項目為行變量，制作交叉頻數(shù)表，根據(jù)四格表資料，得出診斷試驗的方法學評價指標。5項聯(lián)合的敏感性(69.77%)、總正確率(75.93%)和陰性預(yù)測值(59.43%)以及AFP-L3%的特異性(99.37%)和陽性預(yù)測值(99.33%)均高于其他指標。見表5、表6。

表5 5項指標單項及聯(lián)合檢測陽性率(n=6 202)

表6 5項指標單項及聯(lián)合檢測診斷肝癌的方法學評價(n=6 202,%)

3 討論

血清學檢驗?zāi)軌虮扔跋駥W提前3～28個月預(yù)警肝癌發(fā)生，具有時間短，操作簡單，可行性好，準確性高的特點。國際主流的血清學標志物包括 AFP、AFP-L3、DCP等，主要用于肝癌病情動態(tài)監(jiān)測及療效評價。高危人群(慢性乙型、丙型肝炎和非病毒性肝硬化)和極高危人群(乙型或丙型肝硬化)分別應(yīng)間隔6個月和3至4個月進行血清學檢測[8]。

本研究顯示，肝癌治療前后5項指標均高于慢性肝病及肝硬化者(P<0.05)；慢性肝病及肝硬化組和肝癌治療后緩解組男性AFP水平高于女性(P<0.05)，肝癌患者男性DCP水平高于女性(P<0.05)，這與多項研究結(jié)果一致[9-12]。另有學者報道，DCP與AFP之間無相關(guān)性，二者水平變化互不依賴，同時檢測有互補效果。故而，本研究進一步分析各指標數(shù)據(jù)相關(guān)性以及各檢測指標在不同年齡之間的分布規(guī)律。

本研究結(jié)果表明，當單項指標診斷肝癌治療前及治療后未緩解組時，AFP的AUCROC最高(0.914)，GP73的AUCROC最低(0.800)；AFP-L3和AFP-L3%敏感性最高(82.94%)，DCP敏感性最低(69.04%)，AFP-L3%特異性最高(98.22%)，GP73特異性最低(78.34%)，AFP-L3%約登指數(shù)最高(0.812)，GP73約登指數(shù)最低(0.476)。AFP-L3%+DCP+GP73和5項聯(lián)合的AUCROC(0.996)和約登指數(shù)(0.955)最高。聯(lián)合檢測時敏感性83.20%～97.67%，特異性94.89%～98.12%，均高于單項指標。AUCROC越大，代表準確性越高。AUCROC為<0.7 表示有較低的準確性，0.7～0.9為有一定的準確性，>0.9為有較高的準確性。約登指數(shù)反映該診斷技術(shù)發(fā)現(xiàn)患者和非患者的總的能力，即診斷性能。臨界值即約登指數(shù)(即敏感性+特異性-1)最大時對應(yīng)的實驗結(jié)果或預(yù)測概率值?？梢妴雾棛z測AFP準確性最高，AFP-L3%診斷效能最高；AFP-L3%+DCP+GP73和5項聯(lián)合檢測的準確性和診斷效能最高，聯(lián)合檢測優(yōu)于單項檢測。

楊璇等[13]報道采用微流控免疫熒光法檢測AFP-L3% 診斷原發(fā)性肝癌(PHC)的敏感性為66.3%。Sato等[14]報道HCC預(yù)測模型最高預(yù)測準確性為87.34%(AUCROC:0.940)，當臨界值分別為AFP 200 ng/mL、DCP 40 ng/mL和 AFP-L3 15% 時，準確性分別為70.67%(AUCROC：0.766)、74.91%(AUCROC：0.644)和71.05%(AUCROC：0.683)。Shaker等[15]報道GP73和AFP的敏感性、特異性和臨界值分別為96.9%、96.9%、17.5 ng/mL和75%、92%、9.4 ng/mL。周靜娣等[16]報道AFP-L3%診斷肝癌的臨界值為6.10%，特異性76.63%，敏感性61.29%。本研究得出的診斷效能結(jié)果與上述研究不盡相同，分析原因，推測可能與入組研究對象的選取、檢測系統(tǒng)與方法學不同、樣本量大小以及前瞻性和回顧性研究實驗數(shù)據(jù)的差異有關(guān)。

通過Logistic預(yù)測模型，計算出每個樣本聯(lián)合檢測的預(yù)測概率，可以量化各指標對于疾病診斷的貢獻性，對結(jié)果的判定更加客觀，可用于疾病的個體診斷。有學者報道，基于性別、年齡、AFP-L3、AFP和DCP構(gòu)建的GALAD評分系統(tǒng)可提高早期PHC檢出率，當GALAD評分的臨界值為-0.33 時，診斷敏感性、特異性和準確性分別為91.9%、86.8%和90.7%，AUCROC可達0.960[17]。本研究隨機抽取1例不在本次實驗統(tǒng)計范圍內(nèi)的患者，其數(shù)據(jù)為AFP 19.46 ng/mL、AFP-L3 5.11 ng/mL、AFP-L3% 26.25%、DCP 44.92 ng/mL、GP73 139.3 ng/mL，代入Logistic回歸方程，得出Logistic(P)=1.000，大于臨界值的0.362，說明在預(yù)測正確率97.56%的條件下，可判斷患有肝癌。

通過Logistic回歸可分析各指標與肝癌的相關(guān)程度?；貧w系數(shù)(B)表示自變量對因變量貢獻大小，B>0時，表明該變量每增加1個單位，比值比(OR)在原來基礎(chǔ)上擴大B倍。將B進行指數(shù)變換后得到OR值[OR=exp(B)，B=log(OR)]。OR值是反映疾病與暴露之間關(guān)聯(lián)強度的指標，表示影響因素對事件發(fā)生的影響方向和能力大小。該因素取值越大，事件發(fā)生概率越大。OR=1，該因素對疾病的發(fā)生不起作用；OR>1，該因素是危險因素；OR<1，該因素是保護因素?？梢夾FP-L3%與肝癌的關(guān)聯(lián)強度最高(OR=2.780)，而AFP-L3%+DCP+GP73及5項聯(lián)合檢測的疾病預(yù)測正確率最高(97.56%)。

本研究基于所有肝病及肝癌患者數(shù)據(jù)得出檢測陽性率和診斷肝癌的方法學評價指標。AFP作為最常用的肝病項目，其在慢性肝病及肝硬化組、肝癌治療前及治療后未緩解組、肝癌治療后緩解組的陽性率分別為6.37%、79.77%和12.67%，低于多數(shù)組合項目，而3組5項聯(lián)合檢測的陽性率分別提高至11.82%、99.82%和32.94%。表明多種標志物聯(lián)合檢測能提高檢出率，為肝癌的輔助診斷提供依據(jù)。5項聯(lián)合檢測的敏感性(69.77%)和總正確率(75.93%)最高；而 AFP-L3% 特異性最高(99.37%)，但GP73的敏感性和總正確率最低(22.62%和47.44%)，這與多數(shù)文獻報道的結(jié)論一致[12-13，18]。

本研究的局限性主要為由于樣本量巨大，未進行臨床樣本的5項指標數(shù)據(jù)與腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移、分化程度及并發(fā)癥關(guān)系的研究，今后進一步研究方向是分析各指標與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。綜上所述，肝病和肝癌治療前后患者血清5項指標發(fā)生不同程度改變，聯(lián)合檢測運用Logistic和ROC曲線綜合分析，可彌補單項不足，篩選和優(yōu)化組合對肝癌輔助診斷和療效評價具有重要的臨床應(yīng)用價值。