邢天禹，陳慧，高超，陳振萍，賀思豆，蘇雁，馬曉莉

(國家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 a.血液病中心，兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科，兒科重大疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市兒科研究所，血液疾病研究室，b.兒童腫瘤中心腫瘤內(nèi)科，北京市兒童血液腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科重大疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100045)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是一種起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性實(shí)體腫瘤，起病隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。骨髓(bone marrow，BM)是NB最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，患者預(yù)后較差[1-2]。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果是判斷NB骨髓轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)。近年來，隨著對(duì)NB標(biāo)志物的深入研究，檢測方法逐漸豐富。有學(xué)者采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測配對(duì)同源異型盒蛋白2B(paired like homeobox 2B，PHOX2B)基因的表達(dá)[3]，證實(shí)其可以特異性高表達(dá)于神經(jīng)源性細(xì)胞內(nèi)，且在骨髓樣本中的檢測靈敏度可達(dá)10-5數(shù)量級(jí)，但同時(shí)存在操作過程復(fù)雜，對(duì)操作人員要求較高，易出現(xiàn)污染等問題，無法滿足臨床的迫切需求。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry assay，F(xiàn)CM)是一種快速、便捷的臨床常規(guī)檢測技術(shù)[4]。神經(jīng)節(jié)甘脂(ganglioside 2，GD2)作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤表面特異性標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[5]，近年來多項(xiàng)研究應(yīng)用以標(biāo)記GD2為主的多色組合方案FCM進(jìn)行GD2檢測。然而，相關(guān)研究的檢測準(zhǔn)確率均不同，且在大樣本量的兒童臨床檢測應(yīng)用中的相關(guān)報(bào)道較少[6-7]。目前，對(duì)NB細(xì)胞的標(biāo)記方案尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究擬采用CD45/CD56/CD81/GD2四色組合方案的FCM檢測120例NB初診患兒的骨髓樣本，并與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以期為臨床提供快捷、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)納入2019年6月至2020年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治且確診的NB患兒，男64例，女56例，年齡2～187個(gè)月，中位年齡34.5個(gè)月。其中低危組33例，中危組38例，高危組49例?；純涸\斷時(shí)行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查，包括骨髓涂片和骨髓活檢免疫組化檢測，其中1項(xiàng)或全部結(jié)果陽性即可診斷為骨髓侵犯。患兒存在骨髓侵犯37例，無骨髓侵犯83例。NB診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)《兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤診療規(guī)范》2019版[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷：腫瘤組織光鏡下明確診斷為NB；(2)臨床診斷：骨髓涂片或骨髓活檢顯示特征性NB細(xì)胞，伴有尿液(或血清)兒茶酚胺或其代謝產(chǎn)物明顯升高。具有以上任何1條即可入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)患嚴(yán)重的肝腎疾病，血液系統(tǒng)疾病，其他惡性腫瘤，自身免疫病以及經(jīng)化療、放療或免疫治療的患兒予以排除。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理文號(hào)：2017-k-54、2017-114)，并進(jìn)行臨床注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR1800017940，2018-1-1)。NB患兒家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Peridinin葉綠素蛋白(PerCP)標(biāo)記小鼠抗人CD45抗體、R-藻紅蛋白(PE)標(biāo)記小鼠抗人CD81抗體(美國Miltenyi Biotec公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記小鼠抗人GD2抗體、溶血素(美國BD公司)，異藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記小鼠抗人CD56抗體(美國Beckman coulter公司)，高pH值抗原修復(fù)液、過氧化氫酶阻斷劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液、兔抗人Protein Gene Product 9.5抗體(protein gene product 9.5，PGP9.5)、兔抗人突觸素抗體(synaptophysin，Syn)、兔抗人嗜鉻素A抗體(chromogranin A，CgA)均購自北京基因科技公司，蘇木素染液、伊紅染液、分化液、返藍(lán)液(北京九州柏林生物科技公司)，瑞氏染色劑(珠海BASO公司)。NAVIOS流式細(xì)胞儀、Kaluza分析軟件(美國Beckman coulter公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 NB患兒在診斷初期，于髂骨位置取骨髓液制作至少2張骨髓涂片。另采集2 mL骨髓液置于肝素抗凝管中，迅速顛倒混勻，2 h內(nèi)進(jìn)行FCM檢測。相同部位取直徑2 mm，長度1.5～2.5 cm的骨髓組織，外觀可見白色的骨皮質(zhì)和紅色的骨髓質(zhì)，置于10%福爾馬林固定液中保存。

1.3.2FCM 取上述各NB患兒的骨髓樣本，分別設(shè)立1個(gè)對(duì)照管和1個(gè)試驗(yàn)管，各管分別加入PerCP標(biāo)記小鼠抗人CD45抗體10 μL、APC標(biāo)記小鼠抗人CD56抗體5 μL，對(duì)照管加入對(duì)照試劑1 μL，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗人IgG1和2 μL APC標(biāo)記小鼠抗人的IgG1，試驗(yàn)管加入2 μL FITC標(biāo)記小鼠抗人GD2抗體和1 μL APC標(biāo)記小鼠抗人CD81抗體。各管分別加入150 μL骨髓樣本，震蕩混勻，室溫避光溫育20 min。每管加入溶血素工作液(1∶9稀釋)2 mL，振蕩混勻，避光靜止10 min。700×g離心5 min，棄去上清，加入2 mL PBS震蕩混勻。重復(fù)離心，PBS洗滌2次，棄去上清，加入150 μL PBS，24 h內(nèi)上機(jī)檢測。利用前向角散射光(FSC)設(shè)門去除粘連細(xì)胞，以CD45和CD56設(shè)門圈出CD45-CD56+細(xì)胞群，再以CD81和GD2設(shè)門圈出CD81+GD2+細(xì)胞群(NB細(xì)胞)。采用Kaluza流式細(xì)胞儀分析軟件分析細(xì)胞免疫表型，以CD45陰性、CD56陽性、CD81陽性、GD2陽性的細(xì)胞群定義為NB細(xì)胞，并計(jì)算NB細(xì)胞在全部有核細(xì)胞中所占的百分比。

1.3.3骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)

1.3.3.1骨髓涂片檢測 每例患者取至少2張骨髓涂片，瑞-吉氏染色后鏡檢。常規(guī)計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，以觀測到異常菊花團(tuán)樣腫瘤細(xì)胞定義為NB骨髓侵犯。涂片采用HE染色，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脫蠟、脫水。蘇木素染色5 min。常規(guī)透明、脫水、封片后鏡檢。

1.3.3.2骨髓免疫組化檢測 骨髓標(biāo)本用10%福爾馬林固定液固定、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脫蠟、脫水，PBS洗滌3次，每次5 min。切片在抗原修復(fù)液中高壓、煮沸5 min以修復(fù)抗原。濕盒內(nèi)加入內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑避光溫育15 min，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS洗滌3次，每次5 min。加入兔抗人PGP9.5、CgA、Syn一抗工作液(1∶200稀釋)置于濕盒中溫育50 min，PBS漂洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)，室溫溫育20 min，PBS漂洗3次，滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，蘇木素復(fù)染、透明、常規(guī)脫水、封片。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，以顯色為褐色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以Kappa≥0.80為兩者一致性強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1FCM檢測與骨髓活檢結(jié)果的比較 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果陽性為37例，陰性83例；FCM結(jié)果陽性35例，陰性85例。骨髓活檢及骨髓免疫組化檢測結(jié)果見圖1、2。FCM檢測結(jié)果見圖3。

注：A,NB骨髓侵犯；B,無NB骨髓侵犯(HE染色，×400)。

2.2FCM檢測與骨髓活檢結(jié)果的一致性評(píng)價(jià) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)陽性組FCM檢測的準(zhǔn)確率為91.8%(34/37)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)陰性組FCM檢測的準(zhǔn)確率為98.7%(82/83)。見表1。FCM檢測結(jié)果和骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果的一致性較強(qiáng)(Kappa=0.921，P<0.001)。

表1 120例NB患兒FCM檢測與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果的一致性評(píng)價(jià)

3 討論

FCM是臨床檢驗(yàn)重要的技術(shù)之一，其優(yōu)勢在于操作便捷，靈敏度可達(dá)0.01%[9-10]。Nagai等[11]發(fā)現(xiàn)，在NB細(xì)胞膜上CD81的表達(dá)水平高于CD9，應(yīng)用CD45/CD56/CD81方案比CD45/CD56/CD9方案標(biāo)記NB更具有特異性和靈敏性。雖然CD81在NB細(xì)胞上呈強(qiáng)陽性表達(dá)，但其研究可能存在漏洞，本研究發(fā)現(xiàn)在明確無骨髓轉(zhuǎn)移樣本中均有CD81的表達(dá)，因此，單獨(dú)使用CD45/CD56/CD81方案在臨床檢測中是不可行的。湯永民等[6]應(yīng)用CD45/CD56/GD2方案檢測結(jié)果顯示，13例初診病例的骨髓檢測結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果的符合率達(dá)92%。Manenq等[10]采用CD45/CD56/GD2/CD81/CD9/CD90多色方案檢測45例NB樣本，結(jié)果證實(shí)，其與免疫組織化學(xué)結(jié)果比較的準(zhǔn)確率為80%。然而，該方案需采用多種標(biāo)記，在操作時(shí)需要設(shè)立多個(gè)對(duì)照管，難以應(yīng)對(duì)大量的待檢測樣本。目前，對(duì)NB細(xì)胞的標(biāo)記方案尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

本研究采用CD45/CD56/CD81/GD2四色方案的FCM,利用特異性高的CD81和GD2抗體標(biāo)記NB細(xì)胞，更有利于臨床檢測。本研究結(jié)果顯示，37例初診伴有NB侵犯的FCM結(jié)果與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果的符合率為91.8%，與文獻(xiàn)[6]結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了該方案的準(zhǔn)確性。82例無NB侵犯的FCM結(jié)果與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果的符合率為98.7%，其中1例形態(tài)學(xué)陰性，但FCM陽性的患兒結(jié)合基因結(jié)果考慮NB低程度浸潤，也提示該方案具有較高的檢測靈敏度。

綜上所述，CD45/CD56/CD81/GD2四色組合方案的FCM能夠快速檢測NB骨髓侵犯，具有良好的特異性和靈敏度。然而，本研究僅入組診斷初期的NB患兒，未對(duì)在治療過程中的患兒骨髓進(jìn)行評(píng)估，還需要后續(xù)研究以進(jìn)一步分析。