常選妞，楊新玲，楊建平

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；2河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院理學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省高校飼料工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

0 引言

單寧酸是由五倍子提取得到的一種鞣酸，單寧酸結(jié)構(gòu)中含有多酚基團(tuán)，有很強(qiáng)的生理活性功能，單寧酸的抗菌、消炎、促生長和防治腸道腹瀉，抑制大腸桿菌、輪狀病毒的作用在動物營養(yǎng)界被廣泛關(guān)注「1」。關(guān)于單寧酸的測定標(biāo)準(zhǔn)有LY/T 1642-2005《單寧酸分析試驗(yàn)方法》「2」和GB/T 27985-2011《飼料中單寧的測定分光光度法》「3」，這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)針對測定高含量的單寧酸原料，且操作繁瑣、耗時(shí)、所用試劑多。而對基質(zhì)復(fù)雜的常規(guī)配合飼料、濃縮飼料、混合型飼料添加劑中低含量的單寧酸的檢測方法尚未有報(bào)道。本研究建立以高效液相色譜測定飼料中單寧酸方法，方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，適合飼料企業(yè)作為質(zhì)量控制的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀；W2487雙通道紫外可見檢測器；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95.2%)。

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg(精確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，搖勻。該儲備液的濃度為250 μg/mL。

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取不同體積的儲備液，用水配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 樣品前處理

稱取配合飼料樣品5.0 g，濃縮飼料3.0～5.0 g，預(yù)混料1.0 g置于50 mL離心管中，加入20%甲醇溶液25.00 mL，渦旋15 min，8 000 r/min 離心5 min，取出上清液，殘?jiān)?0%甲醇溶液25.00 mL重新提取1次。合并2次提取液，混勻，精密移取提取液適量，50℃氮吹干，加5.00 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，取上清液過0.45 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.3 色譜條件

色譜柱為WatersXB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇：0.1%磷酸水溶液=20:80，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：275 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

單寧酸分子有較強(qiáng)的極性，極易溶于水和一些有機(jī)溶劑中如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等，而在三氯甲烷、正己烷中均不溶。故選擇水、甲醇、乙腈作為提取溶劑反復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用水提取溶劑，回收率低，考慮單寧酸易被氧化，商品用單寧酸做成包被產(chǎn)品，不容易提取出來。甲醇作為提取溶劑，回收率高，但提取液里雜質(zhì)多，基質(zhì)干擾。用乙腈作為提取溶劑，回收率高，基質(zhì)干擾小，故選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 檢測波長的選擇

取單寧酸適量，用20%甲醇溶液配成單寧酸濃度為10 μg/mL的溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～400 nm掃描。結(jié)果表明，單寧酸在275nm處有最大吸收，因此，波長選擇275 nm。

2.3 流動相的篩選與優(yōu)化

單寧酸結(jié)構(gòu)中有多酚羥基和羧基，極性強(qiáng)、在C18柱上幾乎無保留，水中含有一定量的磷酸能增加保留時(shí)間，同時(shí)還能抑制單寧酸氧化和離子化，減少拖尾。采用梯度洗脫，單寧酸峰型完好，無雜質(zhì)干擾，分離色譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 樣品圖譜

2.4 線性范圍

將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成0.5、2、5、10、15、20、30、50 μg/mL的濃度，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程 Y=7 313.47X+7 075.82，R2=0.999 5，顯示在0.5～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限定量限

分別以S/N=3和S/N=10確定檢出限和定量限。配合飼料、濃縮飼料的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。預(yù)混料的檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

以陰性飼料樣品作為空白樣品，進(jìn)行50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3種水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為99.7%，單寧酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～1.2%，符合方法學(xué)要求，說明該方法精密度好，準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)語

建立了飼料中單寧酸測定的高效液相色譜法，本方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確，儀器設(shè)備要求不高，適合飼料企業(yè)質(zhì)量控制使用。