張茜，劉辰辰，張舒雅

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院，淮安市第一人民醫(yī)院，淮安 223300；2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室 組織胚胎學(xué)系，南京 210000；3.南京醫(yī)科大學(xué)康達學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，連云港 222000)

叉頭相關(guān)的磷蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(forkhead-associated phosphopeptide-binding domain，F(xiàn)HAD)普遍存在于原核生物和真核生物的多種蛋白質(zhì)中[1-5]。在真核生物中DNA損傷檢控點介導(dǎo)因子1(mediator of DNA damage checkpoint-1，MDC1)定位于DNA斷裂位點，通過其FHAD區(qū)域募集到活化的細胞周期檢查點激酶2(cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2)，并且在CHK2介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[6]。在酵母和人類的細胞核中發(fā)現(xiàn)了許多含有FHAD的蛋白質(zhì)，它們參與DNA損傷修復(fù)，細胞周期檢測點調(diào)控、mRNA預(yù)處理等[3]。例如，發(fā)芽酵母的釀酒酵母檢查點激酶RAD53(serine/threonine/tyrosine protein kinase RAD53，RAD53)中的FHAD2突變可阻止與磷酸化的細胞周期檢測點蛋白Rad9(checkpoint clamp complex protein Rad9)結(jié)合，從而消除了DNA損傷引起的細胞周期停滯[7]。在人類中，酵母磷脂酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(CDP-diacylglycerol synthase 1，CDS1)的同源物CHK2/hCDS1包含F(xiàn)HAD，其參與了對DNA損傷的細胞周期檢查點反應(yīng)[7-11]。研究表明有FHAD的蛋白參與調(diào)控G2/M DNA損傷檢查點，可防止帶有DNA 損傷的細胞進入有絲分裂(M期)[7]。但當DNA損傷不能及時或準確地修復(fù)，就會導(dǎo)致基因突變、引起細胞死亡或腫瘤的發(fā)生。

已知叉頭相關(guān)的磷蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域1(FHAD1)位于小鼠4號染色體，編碼由236個氨基酸組成的蛋白。目前為止，對于FHAD蛋白家族中的FHAD1在小鼠雄性生殖功能領(lǐng)域的研究幾乎為零。基于FHAD的相關(guān)功能性，本研究主要采用RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別在基因和蛋白水平上對其在雄性小鼠生殖細胞的表達進行研究。磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)是檢測細胞DNA雙鏈斷裂的敏感而有效的指標[12]，磷酸化奈梅亨破損癥候群1(Phosphorylated Nijmegen breakage syndrome 1，p-NBS1)是DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白，并和其他蛋白組成基因修復(fù)復(fù)合體，其在DNA雙鏈修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[13]。利用RNA干擾技術(shù)，siRNA轉(zhuǎn)染GC-2細胞干擾FHAD1表達，檢測γH2AX、p-NBS1水平，初步探討FHAD1在生精細胞DNA損傷修復(fù)中的作用機制。

材料和方法

一、實驗材料

1.動物：0.5 d齡C57BL/6J雄性小鼠(0周齡)5只，體重約1.5 g；1周齡(5.5 d)雄鼠3只，體重約3 g；2周齡(14 d)雄鼠3只，體重約7 g；3周齡(21 d)雄鼠3只，體重約15 g；4周齡(28 d)雄鼠3只，體重約22 g；5周齡雄鼠(35 d)3只，體重約28克。成年雌、雄鼠(42 d)各3只，體重約32 g。均購于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物基地生產(chǎn)部，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2021-0001。

2.細胞：小鼠精母細胞系GC-2來自美國ATCC細胞庫。

3.主要試劑和儀器：蛋白酶抑制劑Cocktail(Merck，美國)；DNA標志物DL1000(TaKaRa，日本)；RNA抽提試劑盒(Qiagen，德國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptRT Master Mix(TaKaRa，日本)；牛血清白蛋白BSA(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；胎牛血清(Gibco，美國)；DMEM(Invitrogen，美國)；羊抗單克隆FHAD1抗體(Santa Cruz Biotech，美國)；兔抗多克隆GAPDH、NBS1、pNBS1抗體(Abcam，英國)；兔抗多克隆γH2AX抗體(Cell Signaling Technology，美國)；山羊抗兔IgG、驢抗羊IgG(Thermo scientific，美國)；ECL試劑盒(Perkin Elmer，美國)；細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)。

二、實驗方法

1.動物取材、處理：頸椎脫臼法處死小鼠。取成年小鼠的心、肝臟、脾、肺、腎臟、腦、肌肉、腸、脂肪、卵巢和睪丸，取各周齡小鼠的睪丸組織，分別放入蛋白裂解液和Trizol中分別用于下一步的蛋白提取和RNA的提取。

2.細胞培養(yǎng)及RNA干擾實驗：GC-2細胞用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板。當細胞生長密度達到50%～60%時，轉(zhuǎn)染siFHAD1(FHAD1敲低組)與siNC(南京吉瑪，陰性對照組)；siRNA：脂質(zhì)體Lipofectamine 2000=1∶0.1(pmol∶μl)，48 h后收集細胞。其中siFHAD1序列：正義鏈UUAAGACGUUUUCUUUCUGCU，反義鏈CAGAAAGAAAACGUCUUAAAU。

3.不同階段生精細胞分離：利用密度梯度沉降法分離生精細胞，精原干細胞從0周小鼠睪丸獲得，粗線期精母細胞從3周小鼠睪丸獲得，圓形精子細胞從5周小鼠睪丸獲得。頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸并去白膜，用小剪刀將曲細精管剪碎至漿糊狀，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，用克-亨氏液(武漢普諾賽)補至20～25 ml，冰上靜置5 min，棄去上清。加入10 ml(1 mg/ml)膠原酶及10 μl(1 mg/ml)的脫氧核糖核酸酶I，37 ℃水浴振蕩約10 min并不時用吸管吹吸，至生精小管消化成極小片段，鏡檢大部分生精細胞從生精上皮分離出來，后加入約30 ml預(yù)冷的克-亨氏液，終止消化。4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入5 ml(濃度1 mg/ml)胰蛋白酶及10 μl(1 mg/ml)的脫氧核糖核酸酶I，37 ℃水浴振蕩約10 min，并不時用吸管吹吸，至鏡檢視野里絕大部分是散在的單細胞，加入約30 ml預(yù)冷的0.5% BSA/克-亨氏液，終止消化。4℃，1 200 r/min，離心5 min，棄上清。細胞沉淀用0.5% BSA/克-亨氏液洗1次，4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清。最后細胞沉淀用15～20 ml 0.5% BSA/克-亨氏液懸浮并經(jīng)40 μm細胞網(wǎng)篩過濾。重力密度梯度形成及上樣等步驟參考文獻報道[14]。

4.RT-PCR：Trizol法提取小鼠的各組織臟器以及各周齡小鼠睪丸RNA。用 RNA抽提試劑盒提取支持細胞、間質(zhì)細胞、精原干細胞、粗線期精母細胞和圓形精子的RNA。然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后進行RT-PCR。引物序列見表1。PCR擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，fhad1 57℃、β-actin57.5℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min。重復(fù)35個循環(huán)，4℃保存。

表1 擴增基因片段的引物序列

5.Western Blot：選用北京碧云天的RIPA蛋白裂解液以及細胞裂解液分別勻漿裂解成年小鼠各組織臟器和GC-2細胞，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量為25 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后棄去封閉液，TBS-T溶液洗3次，每次10 min；FHAD1抗體、NBS1抗體、pNBS1抗體、γH2AX抗體均按照1∶500比例稀釋，GAPDH抗體按照1∶2 000比例稀釋，4℃過夜；TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h；TBS-T洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、fhad1基因在成年小鼠不同組織臟器表達水平

RT-PCR結(jié)果顯示Fhad1 mRNA在小鼠的肺中略有表達，在睪丸中高表達，其他臟器中不表達(圖1)。

圖1 成年小鼠不同組織臟器fhad1 mRNA表達情況

二、FHAD1在成年小鼠不同組織臟器的蛋白表達情況

Western Blot檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)HAD1蛋白情況與mRNA表達一致，在小鼠睪丸中高度表達，在肺中也有所表達(圖2)。

圖2 成年小鼠不同組織臟器FHAD1蛋白表達情況

三、fhad1基因在不同周齡小鼠睪丸的表達

RT-PCR結(jié)果顯示fhad1 mRNA在2周小鼠睪丸開始表達，至3周開始表達量明顯升高并持續(xù)表達至成年小鼠睪丸(圖3)。

圖3 不同周齡小鼠睪丸中的fhad1 mRNA表達情況

四、FHAD1蛋白在不同周齡小鼠睪丸中的表達情況

Western Blot檢測FHAD1在不同周齡小鼠睪丸中的表達，結(jié)果顯示FHAD1在2周小鼠睪丸開始表達，至3周開始表達量明顯升高并持續(xù)表達至成年小鼠睪丸(圖4)，與RT-PCR結(jié)果一致。

圖4 不同周齡小鼠睪丸中FHAD1蛋白表達情況

五、fhad1基因在小鼠不同階段生精細胞中的表達

為了進一步探究fhad1基因在小鼠睪丸中的具體表達定位，我們采用STA-PUT分選出不同階段的生精細胞后，RT-PCR檢測在小鼠不同階段生精細胞中fhad1基因表達情況。結(jié)果顯示fhad1 mRNA主要在粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達(圖5)。

圖5 小鼠不同階段生精細胞中fhad1 mRNA表達情況

六、干擾FHAD1對DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的影響

為了研究FHAD1是否參與了DNA損傷修復(fù)，我們在GC-2細胞中瞬時轉(zhuǎn)染外源性siFHAD1后繼續(xù)培養(yǎng)48 h去敲低FHAD1的表達。Western Blot實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siFHAD1后，F(xiàn)HAD1被成功敲低，表明siFHAD1轉(zhuǎn)染效率較好；與陰性轉(zhuǎn)染對照組相比，敲低FHAD1后DNA損傷分子標記物γH2AX水平顯著上升[(1.99±0.14)vs.(0.99±0.10)]、DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白p-NBS1水平顯著下降[(0.24±0.07)vs.(1.01±0.10)](P<0.001)(圖6)。

與陰性轉(zhuǎn)染對照組比較，*P<0.001圖6 FHAD1敲低后GC-2細胞γH2AX、NBS1、p-NBS1蛋白的表達變化

討 論

DNA損傷會破壞機體細胞、組織及器官。DNA損傷的類型包括：點突變、缺失、插入、倒位或轉(zhuǎn)位和雙鏈斷裂。為了確保細胞周期有序進展，有許多被稱為細胞周期檢查點蛋白的質(zhì)量控制點。這些檢測點蛋白能及時修復(fù)問題以保證細胞周期安全有序進行。目前，依據(jù)細胞周期的順序循環(huán)分為：G1-S期檢查點，S期檢查點，G2期檢查點和M期檢查點。細胞周期調(diào)控需要大量的胞內(nèi)外信號的配合，如果缺乏適當?shù)男盘?，細胞將不能從一個階段進入下一個階段，這種現(xiàn)象稱為細胞周期阻滯。當細胞周期正常時，如果DNA出現(xiàn)損傷，細胞周期停在相應(yīng)檢查點，細胞周期阻滯為細胞提供額外的時間用于修復(fù)損傷，從而減少突變的發(fā)生，避免腫瘤的產(chǎn)生。其中G2/M期阻滯，可以防止帶有DNA損傷的細胞進入有絲分裂期，如果檢查點失活，使損傷DNA進入有絲分裂期，引起基因的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致癌突變的積聚。因此細胞進化出了一種DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)來修復(fù)DNA損傷，高度保守的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答機制可以維持基因組的完整性[15]。眾所周知，與體細胞相比，生殖細胞對于DNA損傷更加敏感。在精子發(fā)生過程中，生物體自有DNA損傷修復(fù)機制能及時修復(fù)來源于外界環(huán)境或生物體自身產(chǎn)生的損傷[16]。目前已知的DNA損傷修復(fù)方式至少有5種，包括堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、錯配修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)、直接修復(fù)等[17]，其中DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand breaks，DSB)修復(fù)是非常重要的一種。已有研究表明包含F(xiàn)HAD的蛋白在細胞周期檢驗點調(diào)控和DNA損傷修復(fù)過程中起重要作用[18]。

精子發(fā)生是一個復(fù)雜的雄性生殖細胞分裂和分化的過程，其中包括精原細胞的有絲分裂，精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的變形最終形成精子[19-21]。在小鼠精子發(fā)生過程中，2周左右開始出現(xiàn)粗線期精母細胞[22]。初級精母細胞的減數(shù)分裂，其前期時間很長，變化過程也很復(fù)雜，包括細線期、合線期、粗線期、雙線期及終變期。粗線期時同源染色體聯(lián)會完全，同源染色體之間非姐妹染色單體交換，此過程發(fā)生主要的遺傳物質(zhì)重組事件，細胞啟動程序性的DSB并通過同源重組途徑進行修復(fù)，以促進同源染色體的交換和分離。如果精母細胞在程序性DSB修復(fù)起始過程中染色體結(jié)構(gòu)不能正常疏松，進而DNA損傷修復(fù)因子不能正確及時地招募到斷裂位點，從而嚴重影響了程序性DSB的修復(fù)、同源染色體的聯(lián)會及交叉互換等過程，最終造成雄性不育[23]。本研究中，RT-PCR和Western Blot實驗均顯示FHAD1在2周齡小鼠睪丸開始有所表達，并且隨著周齡增加，表達量隨之增多；而不同階段生精細胞的RT-PCR結(jié)果顯示fhad1 mRNA主要表達在粗線期精母細胞和圓形精子。以上結(jié)果提示我們FHAD1在雄性小鼠中可能參與了生精細胞的早期發(fā)育，并且可能參與了生精細胞的DNA損傷修復(fù)。

在DSB發(fā)生的同時，位于絲氨酸139位C-端保守區(qū)域內(nèi)的H2AX磷酸化形成γH2AX。因此γH2AX的形成是DSB的一個標志[12]。本研究結(jié)果顯示，干擾FHAD1表達后，DNA損傷分子標記物γH2AX蛋白表達增高，提示DNA損傷變多。NBS1在人類中也稱為Nibrin，通常認為它是一種支架蛋白，用于指導(dǎo)DSB位點上的其他DNA損傷反應(yīng)因子并與之結(jié)合。NBS1與DNA損傷位點附近的磷酸化組蛋白變體H2AX(γH2AX)相互作用，將MRE11/RAD50復(fù)合體轉(zhuǎn)運到核中，復(fù)合體檢測到斷裂并激活共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutated Protein，ATM)。NBS1被ATM磷酸化，并激活下游蛋白質(zhì)，如人體抑癌基因p53、乳腺癌1號基因(breast cancer susceptibility1，BRCA1)和CHK2來協(xié)助修復(fù)和控制細胞周期進程。因此NBS1作為激活DNA損傷修復(fù)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子，在維持基因組的穩(wěn)定和DNA損傷修復(fù)過程中起著重要的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾FHAD1表達能顯著抑制DNA修復(fù)關(guān)鍵蛋白NBS1的磷酸化表達，因此，我們認為，F(xiàn)HAD1可能通過促進NBS1蛋白的磷酸化，進而促進精母細胞DNA的損傷修復(fù)能力。但是FHAD1參與DNA損傷修復(fù)的具體機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究初步探討了FHAD1在雄性小鼠睪丸中的表達及功能，F(xiàn)HAD1為雄性小鼠睪丸特異蛋白，主要表達在粗線期的精母細胞以及圓形精子細胞中。下調(diào)FHAD1基因的表達使GC-2細胞的DNA損傷增加，機制可能與NBS1蛋白的磷酸化有關(guān)，為FHAD1在生殖細胞中的功能探討提供了實驗基礎(chǔ)。