高朵朵，王 垚

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，約占最近診斷的臨床腫瘤的3%，盡管近年來取得了許多關(guān)鍵性的進(jìn)展，但OSCC患者的5年生存率仍不令人滿意，低于50%?；熢谀承┣闆r下是OSCC患者有效的輔助治療。然而，化療藥物耐藥的出現(xiàn)和發(fā)展在很大程度上阻礙了患者療效。因此深入探討口腔鱗狀細(xì)胞癌的致病機(jī)制具有重要意義。NOP2/Sun結(jié)構(gòu)域家族成員2(NSUN2，也被稱為MYC誘導(dǎo)的包含Sun結(jié)構(gòu)域的蛋白[Misu])，是一種核RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，是在mRNA和非編碼RNA中以共價鍵催化5-甲基胞嘧啶形成的主要酶[1]。M5C促進(jìn)mRNA輸出，NSUN2作為甲基轉(zhuǎn)移酶，ALYREF作為M5C解讀器。這種修飾對于穩(wěn)定反密碼子配對和正確翻譯mRNA是必要的，在此過程中NSUN2將S -腺苷蛋氨酸(SAM)提供的甲基轉(zhuǎn)移到目標(biāo)mRNA的胞嘧啶C5上，Cys321作為催化氨基酸，Cys271作為釋放氨基酸。Frye和Watt報道NSUN2介導(dǎo)Myc誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和生長，作為Myc通路的一個新的下游靶點。此外，NSUN2是有絲分裂梭形的一個組成部分，可以使其穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的平滑分裂。到目前為止，多項研究表明NSUN2在肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[2]。然而，NSUN2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的功能作用尚未被闡明。因此本研究旨在探討NSUN2對口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的影響，為口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的診療提供新的作用靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料:口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9與CAL27細(xì)胞和人正?？谇簧掀そ琴|(zhì)細(xì)胞(HOK細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。選取58例我院病理確診的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，所有標(biāo)本的采集均在本人和家屬的許可下進(jìn)行。Trizol購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒MTT購自上海碧云天生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq購自日本Takara公司。NSUN2 siRNA1、NSUN2 siRNA2、pcDNA-NSUN2重組質(zhì)粒由北京擎科生物公司合成。Turbofect購自美國Invitrogen公司。E-cadherin、N-cadherin和GAPDH抗體購自英國Abcam公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國Becton Dickinson公司。qRT-PCR儀器購自美國Bio-Tek Instruments公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染:口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9與CAL27細(xì)胞和人正常口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞(HOK細(xì)胞)加入含10%胎牛血清和100U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育生長。選對數(shù)期的細(xì)胞稀釋并接種在12孔板，次日細(xì)胞密度約為70%時，用空DMEM培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，將細(xì)胞分為①Control組、SN50作用組；②siRNA NC組、NSUN2 siRNA1、NSUN2 siRNA2組；③pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-NSUN2組。按照說明書用Turbofect將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收取細(xì)胞檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2細(xì)胞活力測定:將消化后的細(xì)胞按1.0×103/孔密度鋪在96孔板中，設(shè)置3個重復(fù)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h、24h、48h和72h后，每孔細(xì)胞中添加20μL濃度5mg/mL的MTT工作液，繼續(xù)在37℃中放置4h，將150μL DMSO加入每孔細(xì)胞充分溶解，將細(xì)胞置于酶標(biāo)儀下570nm處檢測各孔細(xì)胞OD值，計算細(xì)胞活力。

1.2.3細(xì)胞侵襲實驗:將Matrigel基質(zhì)膠稀釋后取200μL鋪于Transwell上室，過夜12h待其干燥。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后加入胰酶消化，用無FBS的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，在小室上層加入200μL密度為1.0×105/mL的細(xì)胞懸液，小室的下室中加入500μL含10% FBS的DMEM，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，加入PBS清洗2次，棉簽擦去未侵入的細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定，用新鮮的0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計算不同組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.4qRT-PCR:細(xì)胞組織中加入液氮充分研磨，加入Trizol提取組織和細(xì)胞總RNA，通過分光光度計檢測RNA濃度和純度，再通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，采用SYBR Green法檢測基因的表達(dá)量，用2-△△Ct法計算。按照95℃ 15min，95℃ 30s，60℃ 60s，共40個循環(huán)的程序進(jìn)行qRT-PCR。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5Western blot:將細(xì)胞蛋白樣中加入 RIPA裂解緩沖液，提取蛋白樣品，取50μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，用封閉液在室溫下封閉PVDF膜3h，與特異性一抗(GAPDH、E-cadherin、N-cadherin)在室溫條件下孵育2-3h，用TBST清洗5次，PVDF膜置于二抗稀釋液在37℃條件下孵育1h，每張膜中加入TBST清洗5次，暗室滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件分析實驗結(jié)果，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05時，表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié) 果

2.1下調(diào)NSUN2對CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響:qRT-PCR結(jié)果分析顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者組織中NSUN2表達(dá)量(3.56±3.21)明顯高于癌旁正常組織(1.25±1.06)(P<0.01)；口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9與CAL27細(xì)胞中NSUN2表達(dá)量[分別為(2.07±1.24)、(2.94±0.65)]明顯高于HOK細(xì)胞(1.28±1.49)(P<0.01)。和siRNA NC轉(zhuǎn)染組(0.98±1.06)相比，NSUN2 siRNA1(0.26±0.08)和NSUN2 siRNA2(0.32±0.18)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NSUN2表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。由圖1A-1E結(jié)果顯示，和siRNA NC組相比，NSUN2 siRNA1和NSUN2 siRNA2組CAL27細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)，結(jié)果進(jìn)一步說明下調(diào)NSUN2抑制了CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT。

圖1 下調(diào)NSUN2對 CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響

2.2過表達(dá)NSUN2對CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響:qRT-PCR結(jié)果分析顯示，和pcDNA-3.1(+)轉(zhuǎn)染組(1.09±0.48)相比，pcDNA-NSUN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NSUN2表達(dá)量明顯升高(2.47±1.49)(P<0.01)。由圖2A-2E結(jié)果顯示，和pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-NSUN2組CAL27細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)，結(jié)果進(jìn)一步說明過表達(dá)NSUN2促進(jìn)了CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT。

圖2 過表達(dá)NSUN2對 CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響

2.3下調(diào)或過表達(dá)SUNN2對CAL27細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路的影響:圖3Western blot結(jié)果分析顯示，和siRNA NC組相比，NSUN2 siRNA1組CAL27細(xì)胞內(nèi)TAK1和p65蛋白磷酸化水平明顯降低，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯下降(P<0.01)；和pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-NSUN2組CAL27細(xì)胞內(nèi)TAK1和p65蛋白磷酸化水平明顯增加，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯上升(P<0.01)，結(jié)果進(jìn)一步說明過表達(dá)NSUN2激活了CAL27細(xì)胞內(nèi)NF-κB 通路。

圖3 下調(diào)或過表達(dá)SUNN2對CAL27細(xì)胞內(nèi)NF-κB 通路的影響

2.4上調(diào)NSUN2通過NF-κB通路對CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響:據(jù)圖4A-4B結(jié)果顯示，和Control組相比，SN50作用細(xì)胞后TAK1和p65蛋白磷酸化水平明顯降低，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯下降(P<0.01)。據(jù)圖4C-4G結(jié)果顯示，和pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-NSUN2組CAL27細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01);和pcDNA-NSUN2組相比，pcDNA-NSUN2+SN50組CAL27細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)。進(jìn)一步說明上調(diào)NSUN2通過NF-κB通路促進(jìn)CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT。

圖4 上調(diào)NSUN2通過NF-κB通路對CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響

3 討 論

口腔鱗癌是口腔最常見的惡性腫瘤，約占所有口腔惡性腫瘤的90%[3]。鱗狀細(xì)胞癌的特征是早期復(fù)發(fā)的可能性很大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移頻繁，死亡率高[4]。口腔癌的發(fā)生是一個多因素的過程，涉及許多基因過程，其中致癌基因和腫瘤抑制基因的功能改變。目前對于口腔鱗癌患者尚無有效的治療策略，晚期確診的患者預(yù)后很差。因此尋找可靠的腫瘤生物標(biāo)志物進(jìn)行早期檢測和分子靶點治療至關(guān)重要。多項研究表明NSUN2與細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化、睪丸分化和人類癌癥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶2通過與RPL6相互作用促進(jìn)膽囊癌的腫瘤進(jìn)展[5]。Lu等研究發(fā)現(xiàn)tRNA轉(zhuǎn)移酶NSUN2基因高表達(dá)與頭頸部鱗癌預(yù)后不良相關(guān)[6]。還有文獻(xiàn)報道新型長鏈非編碼RNA核磁共振通過NSUN2和BPTF促進(jìn)食管鱗癌的腫瘤進(jìn)展[7]。在本實驗中，選擇了NSUN2進(jìn)行探討，首先qRT-PCR結(jié)果提示口腔鱗狀細(xì)胞癌患者組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9與CAL27細(xì)胞中NSUN2表達(dá)量明顯升高，推測NSUN2可能參與了口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。接著通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)或下調(diào)了NSUN2在CAL27細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步分析了癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)NSUN2抑制了CAL27細(xì)胞的增殖與侵襲，而過表達(dá)NSUN2則具有明顯的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果與NSUN2在其它腫瘤中發(fā)揮的作用一致，表明NSUN2在CAL27細(xì)胞發(fā)展過程中是發(fā)揮了癌基因的作用。轉(zhuǎn)移的定義是在原發(fā)病灶的間斷部位形成逐漸生長的繼發(fā)腫瘤。癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移必須重新激活一個潛在的胚胎程序，稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。EMT標(biāo)志著轉(zhuǎn)移級聯(lián)的第一步，原發(fā)腫瘤的上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)樣特征。通過這種方式，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞-細(xì)胞的黏附性和頂端-基底極性，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞的表型，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組織，獲得獨(dú)立遷移和侵犯基底膜和血管的能力[8]。發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞失去上皮標(biāo)志物(如E-Cadherin)的表達(dá)，而獲得間質(zhì)標(biāo)志物(如波形蛋白和N-Cadherin)[9]。因此EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)NSUN2表達(dá)后，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升，而過表達(dá)NSUN2則促進(jìn)了CAL27細(xì)胞的EMT進(jìn)程。表明NSUN2對CAL27細(xì)胞的調(diào)控作用也是通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT而實現(xiàn)的。越來越多的研究表明NF-κB通路參與了腫瘤的發(fā)展。如Luo等發(fā)現(xiàn)miR-577在胃癌中通過spr調(diào)控的ERK-NF-κB正反饋環(huán)調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展[10]。另外發(fā)現(xiàn)NF-κB在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá),其表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)密切相關(guān)[11]。檢測了上調(diào)或下調(diào)NSUN2表達(dá)后對NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明上調(diào)NSUN2表達(dá)后，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯上升，激活了CAL27細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，表明NSUN2對CAL27細(xì)胞增殖、侵襲和EMT的調(diào)控作用可能與NF-κB通路的活化有關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，研究結(jié)果表明NSUN2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能與NF-κB通路的激活有關(guān)。我們的實驗結(jié)果為進(jìn)一步了解口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療方法提供了新的思路，值得進(jìn)一步深入探討。