丁毅偉，孫希萌

血流感染是住院患者發(fā)病和死亡的主要原因[1-2]，血流感染患者的生存率與最初給予適當(dāng)?shù)目咕幬镞M(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療相關(guān)。因此，快速鑒定病原菌尤為重要[3]。有研究表明，接受充分實(shí)證治療的厭氧菌血流感染患者的死亡率顯著低于未接受充分實(shí)證治療的患者[4]。因此，在獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果之前，更早和準(zhǔn)確的病原菌鑒定對(duì)于選擇合適的抗菌藥物非常重要[5]。許多直接從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中鑒定病原菌的方法表現(xiàn)出了不同的性能[6-8]。

本研究中HB&L 微生物培養(yǎng)儀國(guó)內(nèi)剛通過(guò)認(rèn)證并且在臨床論證階段，目前僅應(yīng)用于尿液和體液的快速培養(yǎng)，可以短時(shí)間內(nèi)診斷樣本陰性或陽(yáng)性。其采用Alifax 專利激光散射技術(shù)，原理是將激光作為光源，以檢測(cè)散射光強(qiáng)度、頻移及其角度依賴等而得到粒子的相關(guān)信息。在本研究中基于激光散射技術(shù)用來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)瓶中病原菌的生長(zhǎng)，散射信號(hào)被計(jì)算和轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)曲線，實(shí)時(shí)推算培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌濃度，當(dāng)達(dá)到預(yù)設(shè)濃度后機(jī)器報(bào)警提示，這個(gè)過(guò)程僅需1~3 h，而傳統(tǒng)的血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本平板繼代培養(yǎng)時(shí)間為24 h，大大縮短其時(shí)間，獲得的陽(yáng)性菌液直接離心取沉淀，分別用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI?TOF MS)直接鑒定，同時(shí)聯(lián)合VITEK 2 Compact微生物儀直接藥敏試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱快速直接法），并以常規(guī)方法為參考，對(duì)快速直接法用于血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本革蘭陽(yáng)性球菌鑒定以及藥敏的準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來(lái)源 收集解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心門(mén)診及住院患者141 份革蘭陽(yáng)性球菌血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201917100）。

1.2 儀器與試劑 Alifax HB&L微生物培養(yǎng)儀（意大利Alifax公司），Bruker MALDI?TOF 質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）；全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)VITEK 2 Compac（t法國(guó)梅里埃公司）；血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 快速直接法 收集141 例革蘭陽(yáng)性球菌血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本，從血培養(yǎng)瓶中取10μL 陽(yáng)性菌液轉(zhuǎn)種于 2 mL 的 HB&L 培養(yǎng)液瓶中，HB&L 微生物培養(yǎng)儀設(shè)定1.5麥?zhǔn)蠞舛葓?bào)警，當(dāng)儀器達(dá)到1.5麥?zhǔn)蠞舛葓?bào)警后，無(wú)菌取出陽(yáng)性培養(yǎng)液，分別置于2 個(gè)1.5 mL的無(wú)菌 EP 管約 1 mL，均 13 000 r/min 離心 2 min 制備沉淀物。2 份沉淀物分別進(jìn)行如下操作：1 份沉淀物MALDI?TOF 質(zhì)譜儀直接細(xì)菌鑒定，操作步驟見(jiàn) 1.3.3；另 1 份沉淀物 VITEK 2 Compact 儀器直接藥敏試驗(yàn)，操作步驟見(jiàn)1.3.4。

1.3.2 常規(guī)方法 以上收集的141例血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本同時(shí)接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃，5%CO2中培養(yǎng)24 h，待分離培養(yǎng)出單個(gè)菌落按照1.3.3和1.3.4進(jìn)行革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.3.3 MALDI?TOF 質(zhì)譜儀鑒定 將快速直接法的沉淀物吸取1μL涂抹于MALDI?TOF靶板上，常規(guī)方法挑取單個(gè)菌落均勻涂抹在MALDI?TOF靶板上，待上述2份樣本晾干后，在干燥的菌液上加入1μL 甲酸晾干后，再加入IVD HCCA 基質(zhì)溶液1μL，晾干后上機(jī)檢測(cè)，每一步試劑均仔細(xì)滴加覆蓋在每個(gè)樣本上。

1.3.4 VITEK 2 Compact 藥敏操作 將快速直接法的沉淀物吸取適量加入VITEK 2 Compact配套鹽水中，常規(guī)方法是用無(wú)菌拭子挑取單個(gè)菌落放入VITEK 2 Compact 配套鹽水中，以上分別調(diào)至0.5~0.63麥?zhǔn)蠞舛龋缓蟀凑諛?biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.4 鑒定和藥敏試驗(yàn)判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 鑒定結(jié)果 依據(jù)MALDI?TOF 標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌鑒定分值大于等于2.000分，表示能有效鑒定至種；分值1.990~1.700 分之間，表示能有效鑒定至屬；分值低于1.700分，表示鑒定結(jié)果不可靠。

1.4.2 藥敏結(jié)果 VITEK 2 Compact 儀器藥敏結(jié)果參照CLSI M100?S29 文件標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告為敏感（susceptible, S）、中介（intermediate, I）、耐藥（resistant,R）；快速直接方法與常規(guī)方法藥敏比較參照美國(guó)CLSI M23 ? A2 文 件[9]：分 類(lèi) 一 致 性（categorical agreement, CA）指快速直接法與常規(guī)方法的符合率；一般錯(cuò)誤（minor errors,MIE）指參考方法的結(jié)果為R 或S，實(shí)驗(yàn)方法為I，或者參考方法的結(jié)果是I，實(shí)驗(yàn)方法為S 或R；嚴(yán)重錯(cuò)誤（major errors,ME）指參考方法的結(jié)果為S，實(shí)驗(yàn)方法為R；極嚴(yán)重錯(cuò)誤（very major errors,VME）指參考方法的結(jié)果是R,實(shí)驗(yàn)方法為S；它們可接受的誤差范圍分別為CA ≥90%，MIE ≤ 10%，ME ≤ 3%，VME ≤ 1.5%。

l.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 快速直接法鑒定率分析 快速直接法對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定率為93.6%，其中不同菌屬鑒定率分別為葡萄球菌屬91.8%，腸球菌屬94.1%，鏈球菌屬100.0%，其中金黃色葡萄球菌、佩滕科夫葡萄球菌、路登葡萄球菌、里昂葡萄球菌、屎腸球菌、鏈球菌屬鑒定率為100.0%?？焖僦苯臃ㄨb定率與常規(guī)方法（>1.700）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表1。

表1 快速直接法革蘭陽(yáng)性球菌鑒定率分析

2.2 快速直接法對(duì)葡萄球菌藥敏CA 和錯(cuò)誤率分析 收集的141 例血培養(yǎng)革蘭陽(yáng)性球菌陽(yáng)性樣本，葡萄球菌屬85 株，占60.3%(85/141)，其中金黃色葡萄球菌16 株，占18.8%（16/85），凝固酶陰性葡萄球菌69 株，占81.2%（69/85）。金黃色葡萄球菌CA 為100.0%，無(wú)錯(cuò)誤率；凝固酶陰性葡萄球菌藥敏CA均為90.0%以上，在環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平分別出現(xiàn)1例MIE（1.5%），均是3株表皮葡萄球菌；氯林霉素、四環(huán)素和紅霉素各出現(xiàn)1 例ME（1.5%），分別是1 株人葡萄球菌和2 株頭狀葡萄球菌，復(fù)方新諾明出現(xiàn)2 例ME（2.9%），分別是1 株人葡萄球菌和1 株溶血葡萄球菌；氯林霉素和復(fù)方新諾明各出現(xiàn)1例VME（1.5%），均是人葡萄球菌，表2。

表2 快速直接法對(duì)葡萄球菌藥敏的CA和錯(cuò)誤率分析

2.3 快速直接法對(duì)腸球菌藥敏CA 和錯(cuò)誤率分析34例血培養(yǎng)腸球菌陽(yáng)性樣本中，屎腸球菌20株，占58.8%(20/34)，糞腸球菌14株，占41.2%（14/34）。腸球菌藥敏CA 均為90.0%以上，在ME 和VME 無(wú)錯(cuò)誤率；在MIE 中屎腸球菌在紅霉素、呋喃妥因分別出現(xiàn)1 例錯(cuò)誤，分別為5.0%；糞腸球菌MIE 在呋喃妥因出現(xiàn)1例錯(cuò)誤，為7.1%，表3。

表3 快速直接法對(duì)腸球菌藥敏CA和錯(cuò)誤率分析

2.4 快速直接法對(duì)鏈球菌藥敏CA 和錯(cuò)誤率分析血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本分離出的12 例無(wú)乳鏈球菌，CA 為91.7%，僅在替加環(huán)素出現(xiàn)1 例MIE 錯(cuò)誤，占8.3%，錯(cuò)誤為常規(guī)方法I,快速方法R,未出現(xiàn)ME 和VEM錯(cuò)誤，表4。

表4 快速直接檢測(cè)法對(duì)無(wú)乳球菌藥敏CA和錯(cuò)誤率分析

2.5 快速直接法對(duì)頭孢西丁和誘導(dǎo)克林霉素耐藥分析 在85株葡萄球菌中，兩種方法共檢測(cè)到頭孢西丁67株陽(yáng)性，16株為陰性，陰性一致率為100.0%（16/16），陽(yáng)性一致率為97.1%(67/69)，總體一致率為97.6%（83/85），常規(guī)方法有2株檢測(cè)為陽(yáng)性，但快速直接法為陰性。兩種方法誘導(dǎo)克林霉素耐藥32株陽(yáng)性，47株陰性，陰性一致率為92.2%（47/51），陽(yáng)性一致率為94.1%(32/34)，總體一致率為92.9%（79/85）。

3 討論

血流感染是臨床由病原菌侵入的一種嚴(yán)重感染癥狀，易引起高發(fā)病率和死亡率[10-12]，其中革蘭陽(yáng)性球菌引起的感染為27.9%，金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌居主要分離病原菌的前5 位，對(duì)患者健康有一定影響[13]。血培養(yǎng)快速準(zhǔn)確的病原體鑒定和藥敏對(duì)膿毒癥患者非常重要，可大幅度降低膿毒癥的死亡率[10-12]。目前，血液中的病原菌是先培養(yǎng)后鑒定，陽(yáng)性血培養(yǎng)中微生物鑒定的周期約為24~48 h，在此期間患者接受經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療或不接受治療的時(shí)間較長(zhǎng)。近年來(lái)，MALDI?TOF MS 已成為一種快速可靠的技術(shù)，可直接從陽(yáng)性血培養(yǎng)物中快速鑒定病原菌，鑒定時(shí)間能夠縮短到10 h[14-21]，如果直接從血培養(yǎng)物中鑒定容易受到血細(xì)胞影響，從而降低準(zhǔn)確性。同時(shí)藥敏結(jié)果也不能立即獲得，導(dǎo)致患者接受廣譜抗菌藥物治療而不是靶向治療。有研究表明，靶向治療可以縮短患者住院時(shí)間，降低死亡率[22-23]。

基于激光散射技術(shù)的Alifax HB&L 微生物培養(yǎng)儀，使血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本培養(yǎng)時(shí)間縮短至2~3 h，本研究中快速直接法鑒定革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定率為93.6%，與常規(guī)方法一致但高于血清分離膠促凝管法82.3%[24]，不同菌屬鑒定率分別為葡萄球菌屬91.8%，腸球菌屬94.1%，鏈球菌屬100%，其中金黃色葡萄球菌、佩滕科夫葡萄球菌、里昂葡萄球菌、路登葡萄球菌、屎腸球菌、鏈球菌屬鑒定率為100%。表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、溶血葡萄球菌和糞腸球菌快速直接法鑒定率低，其原因可能由于MALDI?TOF MS 技術(shù)是檢測(cè)菌體獲得蛋白質(zhì)圖譜，但革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，獲得的病原菌樣本蛋白質(zhì)圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中圖譜存在差異，因此鑒定分值不高[25]。另有翟鑫[26]等用 MALDI?TOF MS 質(zhì)譜鑒定與核酸擴(kuò)增的基因進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果對(duì)凝固酶陰性葡萄鑒定符合率為100%。85株革蘭陽(yáng)性球菌快速直接法雖然有9株鑒定分值<1.700，但菌名鑒定均正確?？焖僦苯臃ㄔ诳s短血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，與常規(guī)方法在鑒定上具有較高的一致率，能夠?yàn)榕R床快速確定患者血培養(yǎng)中為何種病原體感染提高臨床準(zhǔn)確判斷，有方向性針對(duì)用藥。

臨床革蘭陽(yáng)性球菌引起的血流感染主要是金黃色葡萄球菌[27]，快速直接法檢測(cè)葡萄球菌藥敏顯示，金黃色葡萄球菌CA 為100%，并且無(wú)任何錯(cuò)誤率；凝固酶陰性葡萄球菌常為血培養(yǎng)的污染菌，但其也可引起導(dǎo)管相關(guān)性血流感染和感染性心內(nèi)膜炎[28]，凝固酶陰性葡萄球菌CA 均為90.0%以上。在人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、頭葡萄球菌檢測(cè)氯林霉素、復(fù)方新諾明和紅霉素時(shí)均出現(xiàn)ME 和VME，雖然出現(xiàn)的錯(cuò)誤率較高，但是在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，下一步應(yīng)該加大菌株和藥物的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。本研究中腸球菌無(wú)ME 和VME，腸球菌的血流感染以屎腸球菌為主[13]，屎腸球菌在紅霉素和呋喃妥因各1例MIE，糞腸球菌在呋喃妥因1例MIE。無(wú)乳鏈球菌替加環(huán)素1例MIE。頭孢西丁和誘導(dǎo)克林霉素耐藥的檢測(cè)準(zhǔn)確性，影響臨床對(duì)葡萄球菌的用藥療效，檢測(cè)顯示頭孢西丁陰性和陽(yáng)性一致率分別為100%和97.1%，誘導(dǎo)克林霉素耐藥陰性和陽(yáng)性一致率分別為92.2%和94.1%。

快速直接法與常規(guī)方法比較，能夠達(dá)到很好的鑒定率和藥敏分類(lèi)一致性，由于其準(zhǔn)確性高，總報(bào)告時(shí)間大大縮短，將有助于臨床快速直接鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本革蘭陽(yáng)性球菌，指導(dǎo)用藥，提高患者生存率。