張 蔚，鄺嘉穎，吉 薇，龍慧靜，周秀春

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510225）

山梨酸鉀是經(jīng)由山梨酸與碳酸鉀發(fā)生中和反應(yīng)而生成的，擁有山梨酸基本的性能[1]，作為常用的防腐劑，其價格低廉、毒性小，在防腐過程中可以保持食品原本的色、香、味且營養(yǎng)物質(zhì)不改變。雖然山梨酸鉀毒性小，但使用時仍存有一些不良反應(yīng)，如皮膚刺激性反應(yīng)、過敏性或者超敏性反應(yīng)等，并且部分食品添加劑會超標(biāo)。因此，控制山梨酸鉀的使用含量，保證其使用安全性具有重要的意義[2]。檢測山梨酸鉀含量的方法有拉曼光譜法、熒光光譜法、高效液相色譜法等，其適用范圍僅限于調(diào)味品、飲料、果醬、口服液等食品與藥品。

口服液劑內(nèi)含糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物，容易長出霉菌而發(fā)霉，為了保障口服液的質(zhì)量，某些廠家會向產(chǎn)品中添加一定量的山梨酸鉀，達(dá)到防腐保質(zhì)的目的。此前，也有很多關(guān)于口服液中山梨酸含量測定的文獻(xiàn)，大多數(shù)是研究中藥口服液中的多種防腐劑，但未出現(xiàn)過葡萄糖酸鋅口服液山梨酸含量測定的研究，而葡萄糖酸鋅口服液并非中藥制劑，并且國家并未出臺相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)測定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量。試驗參考有關(guān)資料[3-8]，確定了最適合葡萄糖酸鋅口服液的流動相及系統(tǒng)配置，相比起其他檢測口服液中防腐劑的研究，該方法提高了專屬性、簡化了操作，為葡萄糖酸鋅口服液中的山梨酸鉀含量測定提供一種簡單、高效、便捷、準(zhǔn)確度高的新方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-20A 型四元低壓液相色譜儀及配套色譜工作站、KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器、賽多利斯BSA224S 型十萬分之一電子天平、瑞士梅特勒托利多百萬分之一電子天平等。

1.2 試劑

山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品（批號：101075-201602，含量100.0%），中國食品藥品檢定研究院提供；隨機在市面上購買的葡萄糖酸鋅口服液（批號：20180105，18060727，17092531，170601）；乙腈、甲醇，均為色譜純；水，為超純水；其他溶液均為分析純。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：島津C18型柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長為262 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液

精密稱取山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品約20 mg，置其于100 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

2.2.2 樣品溶液

精密量取樣品5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為樣品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液

精密稱取山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為標(biāo)準(zhǔn)品輔助液。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化

主要對流動相的類型與比例、柱溫、進(jìn)樣量進(jìn)行比較篩選，而流速與檢測波長不作為條件篩選，流速過大會對液相色譜儀造成壓力，1 mL/min 是最合適的流速；檢測波長是因為該方法只研究一種防腐劑，不需要同時測定幾種不同的防腐劑在口服液中的含量，參考相關(guān)學(xué)者的研究[9-10]，最后選擇波長為262 nm。理論塔板數(shù)（按山梨酸鉀峰計） 不低于4 000，山梨酸鉀與相鄰峰分離度符合要求。

3.1.1 流動相的選擇

以A 組（甲醇∶乙酸銨溶液= 5%∶95%）、B 組（乙腈∶水= 40%∶60%）、C 組（0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%） 為流動相進(jìn)行進(jìn)樣。

不同流動相的液相色譜圖見圖1。

由圖1 可知，B 組流動相組合峰形既不美觀也不對稱，而且出峰時間也過早，A 組流動相組合峰形相較C 組流動相組合而言也不夠美觀，C 組流動相組合出峰時間合適，峰形也美觀對稱，故選擇C 組：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%作為流動相。

圖1 不同流動相的液相色譜圖

3.1.2 流動相比例

確定流動相的組成后，用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對照品溶液，在柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，波長262 nm 的條件下，以±5%進(jìn)行流動相比例調(diào)整以達(dá)到更佳的峰形和更合適的出峰時間，發(fā)現(xiàn)75%∶25%已經(jīng)能夠達(dá)到比較理想的效果。

不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動相時的液相色譜圖見圖2。

圖2 不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動相時的液相色譜圖

3.1.3 柱溫

確定流動相的組成和比例后，用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對照品溶液，波長262 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL 時，分別在柱溫為40，30 ℃條件下進(jìn)樣。40 ℃的峰形更加尖細(xì)，出峰時間也相較30 ℃的更合適。

3.1.4 進(jìn)樣量

用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的山梨酸鉀對照品溶液，固定波長262 nm，流速1 mL/min 不變，分別在進(jìn)樣量為20，10 μL 的條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。20 μL 的進(jìn)樣量相較10 μL 的更加合適，峰形也比10 μL 的美觀。

3.2 方法學(xué)驗證

3.2.1 線性范圍

配制質(zhì)量濃度為0.008，0.016，0.032，0.040，0.048，0.064，0.080 mg/mL 的梯度溶液，以質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標(biāo)，峰面積（Y） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)圖3 可知，山梨酸鉀的線性回歸方程為Y=206 812 000X+49 078，R2=0.999 8。結(jié)果說明，山梨酸鉀在質(zhì)量濃度為8.136～81.360 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

線性回歸方程見圖3。

圖3 線性回歸方程

3.2.2 專屬性驗證

專屬性驗證指的是如果樣品除了待測成分以外還存在其他成分時，如輔料、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物等，采用的方法可以正確地測定被測物的能力。按2.2.1的方法得到標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，按2.2.2 的方法得到樣品（批號17092531） 溶液和陰性樣品（批號20180105）溶液對照，記錄出峰時間及峰面積。

專屬性驗證色譜圖見圖4。

圖4 專屬性驗證色譜圖

由圖4 可見，山梨酸鉀峰周圍并無雜質(zhì)峰，標(biāo)準(zhǔn)品儲備液與樣品出峰時間在誤差范圍內(nèi)，且同一時間陰性樣品并未出現(xiàn)色譜峰。證明該方法專屬于山梨酸鉀峰的檢出。

3.2.3 精密度驗證

按2.2.1 的方法得到標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，連續(xù)在液相色譜儀中進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。精密度要在規(guī)定的條件之下，同1 份樣品多次取樣測得結(jié)果之間接近程度，經(jīng)計算得出山梨酸鉀峰面積的RSD 為0.27%（n=6），表明該液相色譜儀的精密度良好，經(jīng)該液相色譜儀的試驗數(shù)據(jù)真實、可靠、準(zhǔn)確。

3.2.4 重復(fù)性驗證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進(jìn)行測定，記錄峰面積。該結(jié)果測得山梨酸鉀含量的RSD 為0.60%，表明該方法的重復(fù)性良好，多次操作結(jié)果都在誤差范圍內(nèi)，該方法所得出的試驗數(shù)據(jù)真實可信。

3.2.5 穩(wěn)定性驗證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進(jìn)行測定，記錄峰面積。試驗結(jié)果測得山梨酸鉀峰面積RSD 為0.52%（n=6），說明樣品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，在8 h 內(nèi)樣品性質(zhì)未發(fā)生改變，可以用于試驗操作，放置8 h 后試驗結(jié)果仍然準(zhǔn)確可靠。

3.2.6 加樣回收率

準(zhǔn)備9 個50 mL 容量瓶，將這9 個容量瓶分成3 組，每組3 個，分組名為“1∶0.8”“1∶1.0”“1∶1.2”；各加入已知含量的樣品（批號17092531）5 mL，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，“1∶0.8”組中加入6 mL 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液，“1∶1.0”組中加入8 mL標(biāo)準(zhǔn)品輔助液，“1∶1.2”組中加入10 mL 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液。加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，進(jìn)行測定，記錄測得的峰面積。根據(jù)線性回歸方程進(jìn)行含量計算及另外進(jìn)行加樣回收率的計算。加樣回收率一般用于測定方法的準(zhǔn)確度，即該方法測定出來的結(jié)果跟參考值或者真實值接近程度，該方法中的山梨酸鉀加樣回收率為98.21%，RSD 為0.53% （n=9），說明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.2.7 耐用性驗證

分別改變柱溫、流動相pH 值，其他條件不變，記錄峰面積并進(jìn)行計算。分別改變柱溫、流動相pH 值，其他條件不變時，測定結(jié)果不受影響，可以為建立的日常檢驗新方法提供依據(jù)。

3.3 樣品含量測定

按2.2.2 的方法制備樣品（批號18060727）、樣品（批號17092531）、樣品（批號170601），進(jìn)行測定，記錄峰面積，按所得出的線性回歸方程進(jìn)行含量計算。

樣品中山梨酸鉀含量測定結(jié)果見表1。

表1 樣品中山梨酸鉀含量測定結(jié)果

4 結(jié)論

研究得出最適合測定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀含量的高效液相色譜條件為流動相0.02 mol/L，磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長262 nm。該方法靈敏度高、可信度高、操作簡便，目前我國尚未有明確的山梨酸鉀添加在藥品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此研究可以為葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量檢測提供參考。