李 劍 金 川 李 銳 楊建東 于 李

（成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610000）

人血白蛋白因具有維持血管內(nèi)膠體滲透壓，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)各種脂肪酸、激素、離子以及多種藥物的重要生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于各種低白蛋白癥或創(chuàng)傷性休克[1]及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水等疾病。近年來，隨著人血白蛋白臨床需求的不斷增加，人血白蛋白的進(jìn)口量不斷增大[2]，2020年進(jìn)口白蛋白已占國內(nèi)批簽發(fā)總量63.96%，而隨著監(jiān)管日趨嚴(yán)格和血漿資源緊缺，國內(nèi)血液制品廠家將面臨更大挑戰(zhàn)，所以不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高血漿綜合利用率和產(chǎn)品質(zhì)量是當(dāng)前各大本土廠家面臨的迫切課題。目前市場上大多數(shù)血液制品企業(yè)采用的是改良后的低溫乙醇工藝 Cohn6/9 法或 N-K（Nitschmann-Kistler）法[3]，該法在低溫乙醇條件下通過在各個(gè)分離階段改變（pH、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度）五變參數(shù)等措施，經(jīng)多步沉淀和壓濾分離，使中間制品固液相分離，使目標(biāo)蛋白不斷純化。在FIV分離階段各個(gè)廠家根據(jù)自身工藝條件、分離步驟及工藝參數(shù)都有所不同，針對FIV制作反應(yīng)結(jié)束后有無靜置及靜置時(shí)間也并不一致，長時(shí)間靜置對產(chǎn)品質(zhì)量及安全性方面影響文獻(xiàn)報(bào)道較少。該實(shí)驗(yàn)采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時(shí)，在FIV階段制作完成后通過有無靜置的不同工藝，來比較2種不同工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

主要材料與設(shè)備包括95%醫(yī)用乙醇 、助濾劑、注射用水、健康人血漿、緩沖液、壓濾機(jī)（EUROFILTEC FC.800. AC）、全自動(dòng)電泳儀（MICROTECH648ISO）、高效液相色譜儀（Agilent1200）、動(dòng)態(tài)試管儀。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時(shí)，在工藝穩(wěn)定的情況下，確保各項(xiàng)工藝參數(shù)的一致性，在FIV制作反應(yīng)結(jié)束后，對2組各16個(gè)投漿批次分別采取無靜置直接壓濾分離和靜置（48h）后壓濾分離的不同參數(shù)控制工藝，將其合并為相對應(yīng)的8個(gè)FV沉淀精制，對批次后續(xù)制劑階段產(chǎn)品的多聚體含量、純度等關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)及其原液內(nèi)毒素含量進(jìn)行分析。工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.1 過濾壓力

取FIV 過濾整個(gè)過程最大壓力作為過濾壓力，記錄2種不同參數(shù)控制工藝所達(dá)到的壓力 （MPa）。

1.2.2 多聚體含量

使用 HPLC檢測人血白蛋白成品的多聚體含量，對比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的產(chǎn)品中多聚體含量的情況。

1.2.3 純度

使用醋酸纖維素薄膜電泳法檢測人血白蛋白成品純度，對比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的產(chǎn)品純度情況。

1.2.4 原液內(nèi)毒素含量

使用動(dòng)態(tài)濁度法測定人血白蛋白原液的內(nèi)毒素含量，對比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的原液內(nèi)毒素含量情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） ”表示，采用獨(dú)立樣本 T 檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)的比較，以P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過濾壓力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)IV階段靜置（48h）后過濾16批人血白蛋白制品過濾壓力為（0.22±0.01）MPa，而無靜置直接過濾16批人血白蛋白制品過濾壓力為（0.29±0.01）MPa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-16.56，P=1.2258E-16，P<0.000），表明采用靜置后過濾在過濾過程中能明顯降低過濾壓力，見圖2。

圖2 FIV反應(yīng)結(jié)束16批次有無靜置過濾壓力變化

2.2 主要質(zhì)量指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)IV階段靜置（48h）后過濾8批人血白蛋白產(chǎn)品純度為（98.29±0.11）%，多聚體為（2.80±0.18）%，而無靜置直接過濾8批人血白蛋白產(chǎn)品純度為（98.20±0.11）%，多聚體為（2.80±0.17）%，2組數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.594和0.000），P分別為0.133和1.000），表明2種不同的FIV參數(shù)工藝在多聚體及純度指標(biāo)上并未表現(xiàn)出明顯變化。見圖3、圖4和表1。

圖3 FIV反應(yīng)結(jié)束有無靜置改變?nèi)搜椎鞍壮善范嗑垠w變化

圖4 FIV反應(yīng)結(jié)束有無靜置改變?nèi)搜椎鞍壮善芳兌茸兓?/p>

表1 FIV反應(yīng)結(jié)束有無靜置過濾主要質(zhì)量指標(biāo)的比較

2.3 原液內(nèi)毒素指標(biāo)

由于中國藥典2020版人血白蛋白原液檢定無內(nèi)毒素限值要求，參考半成品熱原檢查細(xì)菌內(nèi)毒素限值蛋白濃度20%應(yīng)小于1.67EU/ml[4]，將16批FV沉淀合并為相對應(yīng)的8批次FV沉淀精制（每2投漿批次合并為1批FV沉淀精制），經(jīng)超濾后制成原液分別檢測原液內(nèi)毒素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原液內(nèi)毒素含量均處于極低水平。見表2。

表2 FIV反應(yīng)結(jié)束有無靜置原液內(nèi)毒素變化

3 討論

低溫乙醇工藝生產(chǎn)人血白蛋白時(shí)當(dāng)血漿蛋白經(jīng)FI+II+III壓濾分離獲得上清液后，進(jìn)入FIV分離階段，F(xiàn)IV分離純化效果對最終產(chǎn)品的收率和質(zhì)量影響尤為關(guān)鍵。FIV分離純化主要通過制作和壓濾2個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)，在制作過程結(jié)束后通常采用老化和適當(dāng)靜置的方法，延長制品反應(yīng)時(shí)間，促使溶液中等電點(diǎn)蛋白更完全充分沉淀，以期望達(dá)到更好的分離效果。在進(jìn)入過濾階段通過壓濾分離能夠有效去除熱原和各種雜質(zhì)（α-球蛋白、β-球蛋白、凝血酶原、PKA、變性蛋白等），實(shí)現(xiàn)廢棄沉淀和上清液分離，所以為了達(dá)到更佳的固液相分離效果，如何合理選用濾板和助濾劑種類（硅藻土、珍珠巖）及用量，過濾過程溫度保證、過濾壓力、濾液澄清度、流速控制等，將直接影響過濾過程中過濾效果，從而影響壓濾分離質(zhì)量。

有研究表明，為了避免蛋白溶液在離心和泵送過程中，由于高剪切力對沉淀顆粒造成的破壞，在反應(yīng)條件終止后和離心或壓濾操作前，此時(shí)沉淀物已經(jīng)生成，在這種情況下已經(jīng)可以進(jìn)行下一步工藝如壓濾或離心等固液分離步驟，但也可使沉淀物與母液在一定條件下繼續(xù)靜置一段時(shí)間，進(jìn)行“批次老化”，以進(jìn)一步促進(jìn)沉淀形成，使沉淀物的性質(zhì)隨時(shí)間發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)變化，能夠改善分離質(zhì)量[5]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)告相符，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果更進(jìn)一步表明在FIV階段采取靜置（48h）后壓濾分離，與無靜置直接壓濾相比，過濾壓力降低24.14%，分析原因可能是由于在老化和靜置期間，在沉淀的形成過程中沉淀蛋白顆粒強(qiáng)度增加、直徑增大[5]， 晶型完善與晶形轉(zhuǎn)變等密切相關(guān)，制品在低頻條件和靜態(tài)混合過程中，沉淀蛋白的聚合發(fā)生結(jié)構(gòu)上變化，空間構(gòu)型更加穩(wěn)固，對剪切力有較強(qiáng)抵抗力，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，沉淀蛋白質(zhì)顆粒直徑增大，強(qiáng)度增加也有助于在壓濾過程中與助濾劑一起形成更加疏松的濾餅，有利于提高濾過液的流速，從而降低了過濾壓力。而楊宇等的研究表明，各種濾材均有其過濾面積和最大過濾壓力承受負(fù)荷，過濾壓力降低一方面能夠降低過濾過程中因過濾壓力過高帶來的安全隱患；另一方面，如果過濾壓力過高超過濾材最大承受壓力負(fù)荷，將會導(dǎo)致過濾效果下降，影響產(chǎn)品質(zhì)量[6]。而FIV階段在隨著制品不斷過濾，在過濾中后期濾餅厚度增加，過濾壓力出現(xiàn)明顯升高，過濾阻力增大，導(dǎo)致過濾流速緩慢，出現(xiàn)過濾時(shí)間延長現(xiàn)象，而廢棄沉淀收集時(shí)濾餅中液體含量往往較多，所以過濾壓力改變，將直接影響過濾性能。

FIV階段有無靜置成品多聚體及純度指標(biāo)并未表現(xiàn)出明顯變化，可見低溫乙醇工藝由不同的生產(chǎn)工藝模塊構(gòu)成，作為在每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)處于連續(xù)流動(dòng)式運(yùn)行的復(fù)雜生產(chǎn)系統(tǒng)，要在每個(gè)生產(chǎn)工藝步驟獲得最佳的分離純化效果， 須充分考慮五變參數(shù)調(diào)整，對降溫幅度、攪拌速度及緩沖液添加速度等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行細(xì)致研究，單一改變某一非關(guān)鍵工藝過程并不會對最終產(chǎn)品質(zhì)量造成明顯影響。兩者原液內(nèi)毒素含量方面相比，均處于極低的水平，經(jīng)分析長時(shí)間靜置的制品在低溫乙醇條件下儲存于密閉容器中，有效避免與生產(chǎn)環(huán)境空氣中微粒、微生物接觸，而且制品處于低溫乙醇狀態(tài)下也不利于微生物滋生。所以為了確保長時(shí)間靜置過程中制品微生物安全，生產(chǎn)操作過程中人員操作、潔凈室環(huán)境、設(shè)備清潔效果、物料的投放方式等需要保證規(guī)范，并且對其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，避免人員操作過程中無意識情況下將潔凈室微粒、微生物等異物混入制品中，反應(yīng)液在整個(gè)生產(chǎn)周期應(yīng)盡量在密閉容器環(huán)境下生產(chǎn)，保證工藝流程穩(wěn)定和可控，才能保證人血白蛋白生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出安全的產(chǎn)品。

4 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在FIV分離階段采取靜置（48h）后壓濾分離，能夠明顯降低過濾壓力以及單位面積內(nèi)濾板壓力負(fù)荷，防止過濾壓力過高造成濾板構(gòu)造改變乃至破損，從而導(dǎo)致過濾性能下降或失效風(fēng)險(xiǎn)（濾液濁度偏高、濾液渾濁），靜置（48h）后壓濾分離有利于沉淀物的收集，確保固液分離的質(zhì)量。而在產(chǎn)品質(zhì)量方面，2種不同的FIV參數(shù)工藝在多聚體及純度指標(biāo)上并未表現(xiàn)出明顯變化，其最終產(chǎn)品質(zhì)量均符合《中國藥典》要求，在原液內(nèi)毒素含量方面均處于檢測下限，表明FIV階段長時(shí)間靜置能夠確保微生物安全，所以在FIV分離階段適當(dāng)設(shè)定靜置時(shí)間，能夠有效改善制品的分離質(zhì)量，保障產(chǎn)品安全性。