馮 程，張茂美

(常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000)

MicroRNA是一類內(nèi)源性、非編碼的單鏈短RNA分子，能在翻譯和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)[1-2]。他們?cè)谠S多生物過(guò)程中扮演重要角色，如細(xì)胞分化、凋亡、增殖、移動(dòng)、入侵、疾病的產(chǎn)生和癌癥的形成等過(guò)程[3-4]。microRNA-21正調(diào)控于乳腺癌基因。因此，microRNA可作為人類癌癥的生物標(biāo)記物用于癌癥的早期診斷[5]。目前，對(duì)于microRNA檢測(cè)傳統(tǒng)方法有Northern blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)和DNA微陣列芯片檢測(cè)。

電致化學(xué)發(fā)光(ECL)microRNA生物傳感器是將核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)技術(shù)和電化學(xué)分析方法結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)單的新型生物傳感器。為了對(duì)microRNA進(jìn)行高靈敏檢測(cè)以達(dá)到對(duì)癌癥的早期診斷，新型納米材料、DNA分子機(jī)器被廣泛應(yīng)用于microRNA傳感器的構(gòu)建中，有望成為腫瘤早期診斷的新型分子標(biāo)志并應(yīng)用于實(shí)際臨床研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀；CHI610A型電化學(xué)工作站；電子天平；超聲清洗機(jī)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；移液槍；三電極體系：玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極；JBZ-12H 磁力攪拌器； ETC PCR儀， PHS-3C/pH計(jì)。

DNA Primer(A、B、C、H1、H2、H3)購(gòu)于賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司；microRNA-21購(gòu)于大連寶生物有限公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 再生型生物傳感器的制備過(guò)程

將玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)于麂皮上經(jīng)0.3 μm和0.05 μm的三氧化二鋁粉末拋光使成鏡面，并用超純水清洗干凈，再依次用超純水、乙醇、超純水超聲洗滌約5分鐘/次，清洗后的電極置于室溫下晾干，備用。然后，將電極在-0.2 V恒電位下置于2 mL HAuCl4(1%)溶液中沉積30 s，形成一層致密納米金層，以固載組裝完成的DNA鑷子。最后滴加15 μL microRNA-21混合溶液，反應(yīng)1～2 h。即得生物傳感器。

1.2.2 測(cè)試方法和原理

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器制備過(guò)程ECL表征

通過(guò)測(cè)定修飾電極在2 mL的0.1 mol·L-1PBS(pH=8.0)和1 mL的S2O82-溶液混合溶液中ECL強(qiáng)度變化可以表征傳感器的構(gòu)建過(guò)程。在沉積金的電極表面滴加15 μL DNA鑷子溶液(1 μmol·L-1)并孵育16 h后，ECL強(qiáng)度如圖1中曲線所示，由于DNA鑷子上帶有量子點(diǎn)QD與AF488，但此時(shí)DNA鑷子是打開(kāi)的狀態(tài)，所以ECL的信號(hào)較低。再滴加10 μL的MCH以封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性反應(yīng)。孵育40 min后進(jìn)行測(cè)定，ECL信號(hào)如圖3.1中b所示，由于MCH具有一定阻礙電子傳遞的性質(zhì)，因此ECL信號(hào)有所降低。最后滴加microRNA-21混合溶液，孵育2 h，ECL信號(hào)如圖3.1中c所示，由于microRNA-21混合液的加入，使DNA鑷子關(guān)閉，量子點(diǎn)與AF488距離很近，因而AF488把能量轉(zhuǎn)移給量子點(diǎn)，使量子點(diǎn)的ECL信號(hào)大大增強(qiáng)。

圖1 傳感器制備過(guò)程的ECL表征Fig.1 ECL characterization of sensor preparation process

2.2 傳感器制備過(guò)程CV表征

通過(guò)測(cè)定修飾電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液中CV強(qiáng)度變化來(lái)表征傳感器的制備及檢測(cè)過(guò)程。如圖2所示曲線a是玻碳裸電極的循環(huán)伏安圖譜。b是當(dāng)將納米金修飾在電極表面后測(cè)得的曲線，有一對(duì)良好的Fe(CN)33-/4-氧化還原峰，這是因?yàn)閚ano-Au具有優(yōu)良的導(dǎo)電性。曲線c是固載了DNA鑷子，由于DNA鑷子上有熒光材料AF488和量子點(diǎn)，可以加強(qiáng)電子傳遞，所以CV信號(hào)增強(qiáng)。曲線d是滴加了MCH封閉劑，由于MCH封閉劑以封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，有阻礙電子傳遞的作業(yè)，所以CV信號(hào)降低。曲線e是滴加了microRNA-21混合液，DNA分子具有阻礙電子傳遞的性質(zhì)，所以CV信號(hào)減弱。通過(guò)CV表征說(shuō)明傳感器成功制備。

圖2 傳感器制備過(guò)程CV表征Fig.2 CV characterization of sensor preparation process

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了使傳感器具有更優(yōu)異的性能，我們對(duì)DNA鑷子溶液的濃度、microRNA-21混合溶液中的DNA酶-鉛離子的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

DNA鑷子溶液的優(yōu)化：首先在沉積金后的電極上分別滴加15 μL 的0.01、0.1、0.5、1、2、3 μmol·L-1)的DNA鑷子溶液，孵育16 h后，再各滴加10 μL的MCH封閉40 min，最后滴加15 μL同一microRNA-21檢測(cè)液，孵育2 h，再檢測(cè)ECL信號(hào)。如圖3所示，在DNA鑷子的濃度低于1 μmol·L-1時(shí)，隨著濃度的增大，ECL信號(hào)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)DNA鑷子的濃度大于1 μmol·L-1時(shí)ECL信號(hào)基本保持不變，故DNA鑷子的最佳濃度為1 μmol·L-1。

圖3 DNA鑷子溶液濃度的優(yōu)化Fig.3 DNA tweezers optimization solution

microRNA-21混合溶液的鉛離子的濃度的優(yōu)化：首先在沉積金后的電極上滴加15 μL(1 μmol·L-1)的DNA鑷子溶液，孵育16 h后，再滴加10 μL MCH封閉40 min，最后分別滴加15 μL分別含有1、5、10、20、30(μmol·L-1)鉛離子的microRNA-21檢測(cè)液，孵育2 h，最后檢查ECL信號(hào)。ECL信號(hào)如圖4所示，在鉛離子的濃度小于10 μmol·L-1時(shí)，隨著濃度的增大，ECL信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)鉛離子的信號(hào)大于10 μmol·L-1時(shí)ECL信號(hào)基本保持不變，所以鉛離子的最佳濃度為10 μmol·L-1

圖4 Pb2+濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of Pb2+ concentration

2.4 ECL生物傳感器的ECL信號(hào)響應(yīng)特性

本實(shí)驗(yàn)研究了在最優(yōu)條件下ECL生物傳感器孵育了不同濃度的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的傳感器的響應(yīng)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：如圖5所示，ECL強(qiáng)度隨著microRNA-21濃度的增加而增加。因?yàn)閙icroRNA-21的濃度越大DNA鑷子關(guān)閉的越多，所以ECL信號(hào)越大。在10 pmol·L-1到0.0001 pmol·L-1濃度范圍內(nèi)，ECL的強(qiáng)度與microRNA-21的濃度呈線性關(guān)系(如插圖)。線性方程為I=5876.08+1254.98 lgc，相關(guān)系數(shù)R為0.99468。檢出限為0.03 fmol·L-1

圖5 傳感器對(duì)于不同濃度microRNA-21混合溶液的響應(yīng)曲線Fig.5 sensor response curves for different concentrations of microRNA-21 mixed solution, concentration of microRNA-21 mixed solution

3 結(jié) 論

以ECL為基本檢測(cè)手段，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA-21的超靈敏檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以具有發(fā)光效率高、穩(wěn)定性好的CdSe@ZnS量子點(diǎn)作為電致化學(xué)發(fā)光體，選擇發(fā)射光譜較寬的熒光材料AF488作為能量轉(zhuǎn)移供體，量子點(diǎn)作為能量受體接受供體傳遞的能量，從而有較強(qiáng)ECL響應(yīng)；并且成功構(gòu)建基于DNA酶引發(fā)的目標(biāo)物循環(huán)放大，以DNA分子機(jī)器—DNA tweezer為模板的再生型ECL生物傳感器，而實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA-21的高靈敏檢測(cè)，建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測(cè)快速的microRNA-21檢測(cè)方法，對(duì)于microRNA的檢測(cè)具有非常重要的意義，為microRNA-21檢測(cè)及生物傳感領(lǐng)域提供一個(gè)新的平臺(tái)。