阮安民,王慶甫,馬玉峰,陳 譜,周 俊,宗晨鐘,殷岳杉

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形等癥狀為主的退行性肌肉骨骼疾病。目前隨著老齡化步伐的加快，全球60歲以上人群中膝骨關(guān)節(jié)炎男性發(fā)病率約為9.6%，女性約為18%，長期發(fā)作的疼痛、腫脹等癥狀嚴重降低了患者的生活質(zhì)量[1]。然而膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不清楚，至今仍沒有理想的治療手段，其中非甾體類抗炎藥作為治療膝骨關(guān)節(jié)炎的一線用藥，長期服用對人的消化系統(tǒng)及肝腎造成損傷，而晚期只能依賴膝關(guān)節(jié)置換，受到個人、家庭以及社會因素的影響，膝關(guān)節(jié)置換不可能成為一種普及的治療方式[2]，因此人們更樂于接受非藥物和非手術(shù)療法。電針療法作為傳統(tǒng)中醫(yī)治療手段和現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合的治療方式，廣泛用于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，能夠明顯改善患者疼痛、腫脹及關(guān)節(jié)功能障礙，具有效果好、安全、經(jīng)濟等優(yōu)點[3-4]。然而電針治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機制不清，因此本實驗從固有免疫的角度觀察了電針療法對于膝骨關(guān)節(jié)炎兔滑膜組織中核因子-κB(NF-κB)信號通路及其下游炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的影響，探討電針的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 健康6月齡新西蘭大白兔24只，雌雄各半，體重2.0～2.5 kg，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-0005。清潔級飼養(yǎng)，實驗室室溫(22±1)℃，空氣濕度40%～50%。實驗經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準，盡可能減少動物使用數(shù)量并將動物的痛苦減少至最低限度。

1.2主要儀器和試劑 一次性使用針灸針，規(guī)格：0.25 mm×25 mm(中國)；英迪脈沖針灸治療儀，KWD-808I型(中國)。兔基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(abcam，美國)；Toll樣受體2(TLR2)、NF-κB、髓樣分化因子88(MyD88)單克隆抗體(abcam，美國)。

1.3實驗方法 按隨機數(shù)字表法將24只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、電針組，每組8只。空白組不予處理，模型組及電針組采用改良Hulth法[5]制備單膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型：戊巴比妥鈉水溶液(3%濃度，1 mL/kg)麻醉后，左膝關(guān)節(jié)備皮，予以手術(shù)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶,切除關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板，術(shù)后用生理鹽水和絡合碘充分沖洗關(guān)節(jié)腔并逐層縫合切口，用無菌敷料包扎傷口。為預防術(shù)后傷口感染，給予換藥及肌注慶大霉素注射液(0.125 mL/kg)，每日1次，連續(xù)3 d。術(shù)后不固定患肢，驅(qū)趕動物縮短造模時間，4周后造模完成。造模結(jié)束后，空白組及模型組正常飼養(yǎng)；電針組參照《實驗針灸學》[6]與《實驗動物針灸手冊》[7]選取內(nèi)膝眼、犢鼻、陰陵泉、陽陵泉、血海、梁丘穴，用毫針進行針刺，內(nèi)膝眼、犢鼻采用斜刺法，其余各穴直刺約5 mm。采用英迪脈沖針灸治療儀進行電針治療，選取2組電針，一組為梁丘(正極)、血海(負極)，一組為犢鼻(正極)、內(nèi)膝眼(負極)。疏密波，強度1～2 mA，以兔下肢微微抖動為度，每次20 min，隔日治療1次，每周治療3次，共治療2周。

1.4觀察指標及方法

1.4.1行為學 造模結(jié)束及術(shù)后2周，采用改良膝骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度指數(shù)(Lequesne MG)對各組兔的局部疼痛、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍和關(guān)節(jié)腫脹程度的刺激反應情況進行評估，記錄總評分。

1.4.2關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13水平 治療結(jié)束后，根據(jù)兔體重注射3%戊巴比妥鈉水溶液后將其固定好，于關(guān)節(jié)外側(cè)進針，向關(guān)節(jié)腔中注射1 mL生理鹽水，反復活動關(guān)節(jié)后，回抽0.5 mL，經(jīng)離心后，取上清液于-20 ℃低溫保存。 將關(guān)節(jié)沖洗液樣本室溫解凍后搖勻，按照試劑盒操作步驟，應用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組兔關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13水平，每個指標設置3個復孔。

1.4.3滑膜組織病理觀察 空氣栓塞處死各組兔，消毒鋪巾后打開膝關(guān)節(jié)，先肉眼觀察滑膜、關(guān)節(jié)軟骨的情況，完整切取滑膜組織。部分滑膜標本放入4%多聚甲醛中固定后取出修剪，置于包埋盒中，采用乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋并進行切片，然后用蘇木精-伊紅(HE)染色，依次將染色好的組織片置于顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照留圖。

1.4.4滑膜組織中TLR2、NF-κB、MyD88蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測。 取液氮冷凍后的滑膜組織，剪碎研磨后加入200 μL預冷的RIPA蛋白裂解液于冰上充分裂解30 min；4 ℃低溫離心機15 000 r/min離心30 min后，吸取上清液置于新EP管中，并進行標記。BCA蛋白質(zhì)試劑盒(美國Thermo Scientific公司)測定每個樣本中的總蛋白濃度并進行變性處理，使各組蛋白濃度一致，然后在SDS-PAGE凝膠上分離，將蛋白分子轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜完全浸沒3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min。用3%BSA-TBST稀釋一抗，參照TLR2、NF-κB、MyD88及內(nèi)參β-actin各抗體說明書進行一抗標記，然后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體(Abcam，US)培養(yǎng)樣品，最后與高靈敏度ECL化學發(fā)光試劑(Peprotech，UK)反應后生成圖像。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料若符合正態(tài)分布檢驗和齊性檢驗，2組數(shù)據(jù)對比采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計處理，若有一項不符合，則釆用非參數(shù)統(tǒng)計中的多個獨立樣本秩和檢驗進行統(tǒng)計處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組兔行為學Lequesne MG指數(shù) 空白組兔行為學Lequesne MG指數(shù)為0分，模型組兔造模結(jié)束及術(shù)后2周的Lequesne MG指數(shù)分別為(7.88±0.29)分和(7.63±0.26)分，電針組分別為(7.50±0.38)分和(3.75±0.37)分。模型組及電針組造模結(jié)束時Lequesne MG指數(shù)均顯著高于空白組(P均<0.05)，模型組及電針組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),術(shù)后2周電針組Lequesne MG指數(shù)顯著低于造模結(jié)束時及模型組(P均<0.05)。

2.2各組兔關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13水平 模型組關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13水平均顯著高于空白組(P均<0.05)，電針組TNF-α、MMP-13水平均顯著低于模型組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組家兔關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13表達情況

2.3各組兔滑膜組織HE染色表現(xiàn) 空白組兔滑膜組織結(jié)構(gòu)由1～2層的滑膜細胞構(gòu)成，細胞之間呈瓦片狀排列，HE染色顯示滑膜襯里細胞呈單層或雙層結(jié)構(gòu)分布，無增生、肥大、壞死及炎性浸潤；滑膜組織krenn評分為(0.25±0.16)分。模型組兔的滑膜組織可見不同程度的充血水腫，局灶性淋巴、單核和漿細胞炎性浸潤明顯，滑膜下組織纖維化密集，可見增生毛細血管；滑膜組織krenn評分為(6.13±0.29)分，明顯高于空白組(P<0.05)。電針組兔滑膜增生及淋巴細胞浸潤相比于模型組明顯減少；滑膜組織krenn評分為(3.25±0.25)分，明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組兔滑膜組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組兔滑膜組織中TLR2、NF-κB及MyD88蛋白表達情況 模型組滑膜組織中TLR2、NF-κB及MyD88蛋白表達量均顯著高于空白組(P均<0.05)，電針組滑膜組織中TLR2、NF-κB及MyD88蛋白表達量均顯著低于模型組(P均<0.05)。 見圖3及圖4。

圖3 各組兔滑膜組織中TLR2、NF-κB及MyD88蛋白表達情況

3 討 論

中醫(yī)認為膝骨關(guān)節(jié)炎屬“痹證”范疇，《素問·痹論》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也?！盵8]痹證為風、寒、濕等邪氣侵襲人體，導致經(jīng)絡痹阻不通，營衛(wèi)澀滯引起氣血運行不暢，而使關(guān)節(jié)產(chǎn)生疼痛、重著、屈伸不利甚至腫大畸形的一系列癥狀。目前大多醫(yī)家認為膝骨關(guān)節(jié)炎基本病機為本虛標實，患者多為中老年人，本肝腎不足，氣血虧虛，不足以濡養(yǎng)筋脈，再遇三邪入侵，故發(fā)為此病。

圖4 各組兔關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、NF-κB及MyD88蛋白表達水平

西醫(yī)認為膝骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性肌肉骨骼疾病，其病變累及軟骨、軟骨下骨質(zhì)并包括滑膜、關(guān)節(jié)囊等關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為全方位、多層次、不同程度的慢性炎癥[9]。以往研究認為該病是由超負荷或過度使用引起的與骨骼相關(guān)的透明軟骨疾病，隨著研究的深入，滑膜炎癥在膝骨關(guān)節(jié)炎病理和臨床中的重要作用逐漸被認識，在許多膝骨關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)展過程中關(guān)節(jié)滑膜可以發(fā)生明顯變化，甚至發(fā)生于軟骨退行性變之前，單核細胞浸潤、滑膜襯里層增厚和炎癥細胞因子產(chǎn)生，形成非感染性慢性炎癥的特征，逐漸導致軟骨損傷，并形成級聯(lián)放大效應而加速軟骨退變[10-13]。

目前關(guān)于滑膜炎癥在膝骨關(guān)節(jié)炎中作用的研究逐漸增多，滑膜固有免疫應答學說是較為公認的機制，是機體防御各種病原體入侵的決定性屏障[14]。隨著關(guān)節(jié)的退變，被破壞的細胞外基質(zhì)及脫落的碎片進入關(guān)節(jié)腔，刺激滑膜啟動固有免疫應答，促進炎性介質(zhì)釋放進入滑液，這種介質(zhì)可刺激滑膜和軟骨形成炎癥反應，進一步破壞關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境[10]。NF-κB介導的信號通路在其中發(fā)揮著重要作用，其上游Toll樣受體是固有免疫應答中一類重要模式識別受體，通過識別體內(nèi)損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)后被激活，激活后的Toll樣受體與胞質(zhì)內(nèi)銜接蛋白如MyD88結(jié)合形成復合物，經(jīng)過系列反應進而激活NF-κB信號通路，從而啟動下游TNF-α、MMP-13等炎性因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，并在關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生炎癥級聯(lián)放大效應，使炎癥反應持續(xù)，進一步加速骨關(guān)節(jié)炎病變進程[15]。TLR2、TLR4作為代表性的TLRs在骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應病程進展中通過參與NF-κB等信號轉(zhuǎn)導途徑誘發(fā)下游炎性因子、蛋白水解酶的大量產(chǎn)生[16]。Wang等[17]認為固有免疫系統(tǒng)密切參與了膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨和滑膜病變過程的每個階段，這些發(fā)現(xiàn)也證實了滑膜可能通過固有免疫系統(tǒng)影響軟骨的病理改變，從而影響骨關(guān)節(jié)炎的進展。

電針療法是在針灸基礎上發(fā)展起來的一種針刺與電脈沖相結(jié)合的物理治療方法，具有多層面、多途徑、多靶點的特點。其可能是通過調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)功能釋放激素、自主神經(jīng)系統(tǒng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)、信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)細胞因子的分泌以及機體的免疫應答，從而有效減輕患者的臨床癥狀[18-19]。

本實驗結(jié)果顯示，造模結(jié)束時模型組及電針組Lequesne MG指數(shù)明顯高于空白組，說明造模導致兔行為學發(fā)生明顯變化，造模成功；電針組干預2周后Lequesne MG指數(shù)明顯下降，說明電針療法能夠明顯改善兔關(guān)節(jié)功能，減輕疼痛。HE染色顯示模型組兔滑膜組織可見不同程度的充血水腫，局灶性淋巴、單核和漿細胞炎性浸潤明顯，滑膜下組織纖維化密集，可見增生毛細血管；電針組增生及淋巴細胞浸潤比模型組輕；模型組關(guān)節(jié)液中TNF-α、MMP-13水平及滑膜組織中TLR2、MyD88、NF-κB蛋白表達量均高于空白組，電針組均低于模型組。提示電針療法可能是通過抑制NF-κB信號通路，降低下游TNF-α、MMP-13的表達而改善膝關(guān)節(jié)功能狀態(tài)，減輕膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥，進而起到治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。