河北中醫(yī)學院

安家盛 周 正△ 黨偉麗△ 張永輝 孫 鑫 孫艷紅 張曉萌 張露露 高紹芳(石家莊 050091)

提要 目的： 通過研究甘麥大棗湯對注意缺陷多動障礙(ADHD)模型動物自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)行為學變化、前額葉皮質(zhì)層損傷的影響，探究本方治療ADHD的作用機制與“脾藏意”理論的聯(lián)系。方法： SHR大鼠隨機分為甘麥大棗湯組(GMDZ組)，利他林組(MPH組)和模型組(Model組)，每組8只，另設8只韋斯達-京都大鼠(WKY)大鼠為空白對照組(Control組)，適應性飼養(yǎng)7 d后，各組大鼠藥物灌胃21 d。進行為期6 d的Morris水迷宮實驗評估藥物對SHR大鼠學習能力, 沖動、多動行為的影響； 通過蘇木精-伊紅(HE)染色、TUNEL染色觀察大鼠前額葉皮質(zhì)層病理形態(tài)變化。結(jié)果： 空白對照組大鼠可見錐體細胞排列緊密，層次分明，結(jié)構(gòu)有序，細胞形狀規(guī)則，細胞核清晰可見，呈現(xiàn)深染，神經(jīng)元細胞數(shù)量多，未觀察到凋亡細胞；模型組大鼠見錐體細胞排列稀疏，層次不清，結(jié)構(gòu)混亂，細胞形狀不規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)大多不清晰，神經(jīng)元細胞數(shù)量較少，排列不齊，結(jié)構(gòu)不完整，可見大量凋亡細胞；甘麥大棗湯組和利他林組可見錐體細胞排列較為緊密，層次比較分明，結(jié)構(gòu)有序，細胞形狀大多規(guī)則，細胞核多數(shù)清晰可見，呈現(xiàn)深染，神經(jīng)元細胞數(shù)量尚可，排列比較整齊，結(jié)構(gòu)較為完整，可見少量凋亡細胞。結(jié)論： 甘麥大棗湯可以有效緩解ADHD模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)層損傷，改善SHR大鼠關于ADHD的核心癥狀。

根據(jù)DSM-5(精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第五版)，注意缺陷多動障礙(ADHD)是指主要發(fā)生于兒童時期,表現(xiàn)為持續(xù)注意力不集中,活動過度,沖動、多動，導致學習、交流甚至工作困難為主要特征的精神障礙綜合征。目前ADHD已經(jīng)是最常見的一種精神障礙[1]。然而關于ADHD確切病因目前仍不清楚，目前在多種假說中以“多巴胺能神經(jīng)傳遞異?！陛^為公認，其中多巴胺受體D1(DRD1)與多巴胺受體D2(DRD2)常作為多巴胺能神經(jīng)傳遞功能的檢測指標。西醫(yī)治療主要采用興奮中樞神經(jīng)類藥物利他林，但因其主要成分為苯丙胺類衍生物，故存在食欲下降、失眠、腹痛等副作用，且停藥后癥狀反跳明顯。中醫(yī)并無與ADHD完全對應的病名，一般在屬“臟躁”治療范疇[2]，且有不可替代的優(yōu)勢[3]。根據(jù)癥狀，其病因可歸納為先天稟賦不足、后天調(diào)護不當、臟腑功能失常、陰陽平衡失調(diào)所致，其主要病變在心、肝、脾、腎。治療基本原則為補虛瀉實、調(diào)理陰陽、平衡臟腑等。根據(jù)不同證候類型,分別給予清熱化痰、健脾養(yǎng)心、清心平肝、滋水涵木、抑木扶土等治法[4]。同時還可以配合中成藥、針刺療法等治療，結(jié)合患兒具體情況對其進行心理教育,行為矯正等綜合訓練治療[5]。

根據(jù)課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者中醫(yī)分型以脾虛證最為常見[6]，因此本實驗決定從“脾藏意”角度入手，通過檢測大鼠腸道菌群的分布來探究脾功能對ADHD的影響?！端貑枴ば魑鍤馄吩?“心藏神,肺藏魄,肝藏魂,脾藏意,腎藏志。”脾的功能直接影響“意”，故脾功能與人的精神狀態(tài)有密切的聯(lián)系。從生理學的角度觀察得到,胃腸道的肽類分泌細胞和腦內(nèi)的肽類神經(jīng)元在胚胎發(fā)生上是共同起源于神經(jīng)外胚層。腦主宰了內(nèi)分泌系統(tǒng),又是激素的作用目標之一。腦腸肽這一物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)表明,大腦和消化道之間在起源和功能上有密切關系,同時還意味著在外周大腦外的遞質(zhì)能產(chǎn)生大腦內(nèi)遞質(zhì)類似的功能[7]。這為解釋“脾藏意”的現(xiàn)代機制提供了證據(jù)和線索。課題組從“脾藏意”理論入手，選取《金匱要略》中的治療“臟躁”的主要方劑甘麥大棗湯作為研究藥物，遵循“肝苦急,急食甘以緩之”的治法,從脾著手,用甘潤之劑調(diào)補脾胃,以滋諸臟氣陰[8]。

前額葉皮質(zhì)對調(diào)控目的性行為有重要的作用，與記憶、注意、人格發(fā)展有密切聯(lián)系。在ADHD的發(fā)病中，前額葉皮質(zhì)的功能異常也發(fā)揮著重要作用。有影像學實驗表明[9]，在核磁共振成像檢查下，ADHD患兒前額葉皮質(zhì)層區(qū)域激活明顯減少，且白質(zhì)纖維完整性與正常兒童有所區(qū)別。另有試驗表明[10]，近紅外光譜成像顯示下，ADHD患兒存在前額葉皮質(zhì)功能受損，以左側(cè)更為嚴重。有動物實驗研究表明[11]，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)與對照組相比，前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡率明顯提高，差異有顯著性。這都表明了前額葉皮質(zhì)層功能的正常與否可能對ADHD的發(fā)病有著重要影響。故本課題組選用目前最為公認的SHR大鼠作為實驗組，利他林作為對照藥物，選取前額葉皮質(zhì)層HE染色與TUNEL染色作為檢測指標，觀察給藥后各組大鼠行為學與上述各項指標的變化，探究本方治療ADHD的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SHR雄性大鼠24只，WKY雄性大鼠8只，均為SPF級，4周齡，購置于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。于河北中醫(yī)學院橘泉校區(qū)進行飼養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)7 d，自然光照，自由進食飲水。

1.2 主要藥物 甘麥大棗湯藥物全部購置于河北中醫(yī)學院國醫(yī)堂中藥房，所有顆粒由神威藥業(yè)提供，批號甘草20052741、小麥20081721、大棗20080411。中藥顆粒溶液按照生藥量甘草10 g， 小麥15 g， 大棗10 g配制而成， 甘麥大棗湯組按照每只每天7.3 g/kg劑量進行藥物灌胃。利他林片(18 mg×15片)，購置于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房，藥物批號(9LE783A)。加入生理鹽水配置成利他林溶液，利他林組按照每只每天0.02 mg/kg劑量進行藥物灌胃。

2 方法

2.1 分組方法 24只4周齡雄性SHR大鼠，按照隨機數(shù)字表法隨機分為甘麥大棗湯組(GMDZ組)8只，利他林組(MPH組)8只，模型組(Model組)8只； 8只4周齡雄性WKY大鼠設置為空白對照組(Control組)。

2.2 動物給藥方法 根據(jù)9周歲兒童體表面積和4周齡大鼠體表面積換算后得出各組大鼠每只每天灌胃量為1.5 mL/100 g，每天早晨9:00進行稱重，根據(jù)大鼠當日體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。甘麥大棗湯組、利他林組分別給予對應藥物，模型組與空白對照組給予等量生理鹽水。每日定時灌胃1次，累計灌胃21 d。

2.3 Morris水迷宮試驗 灌胃21 d后，各組大鼠進行Morris水迷宮實驗。以平臺所在象限對面象限作為起始象限，依次將大鼠面向壁沿放入水池中，每次測試時間為120 s，若大鼠登上平臺且停留時間到達5 s，則記錄自動停止并記為逃避潛伏期，休息10 s后開始下一象限測試；若未找到平臺，則逃避潛伏期記為120 s，將大鼠引導至平臺處停留10 s，以便其記憶平臺位置，后開始下一象限測試。逃避潛伏期為測試大鼠注意力與學習能力指標。第6 d時移除平臺，于原平臺對角象限將所有大鼠面向壁沿放入水池中，記錄其120 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)、平臺象限停留時間、平均速度與規(guī)定時間內(nèi)總路程，以評估其沖動多動行為。

2.4 前額葉皮質(zhì)層病理形態(tài)觀察 大鼠使用2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，打開胸腔后使用10%多聚甲醛溶液進行心臟灌注，待大鼠尾部伸直僵硬后使用斷頭器斷頭，于冰盤上迅速剝離出大腦，放入10%多聚甲醛溶液中固定。后經(jīng)不同濃度乙醇逐級脫水，浸臘包埋，使用切片機制作成石蠟切片，分別用于蘇木精-伊紅染色以及TUNEL染色，觀察大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞損傷情況。

2.4.1 HE染色: (1)切片，多聚甲醛溶液中的腦組織取出后，石蠟包埋并切片，厚度4 μm; (2) 脫蠟，將切片放入二甲苯(I)溶液內(nèi)浸泡10 min；取出后放入二甲苯(II)溶液10 min; (3)水化，將脫蠟后的切片放入無水乙醇中浸泡清洗5 min，取出后再依次放入95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中浸泡清洗5 min，取出后用蒸餾水將乙醇清洗干凈; (4)蘇木精染色，切片自然晾干，放入蘇木精中浸泡5 min染色，取出后用蒸餾水進行清洗3 s左右; (5)分化，將切片放于1%鹽酸乙醇中進行分化，清洗之后浸泡于蒸餾水中5 min; (6)脫水，將切片依次放入50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中分別浸泡5 min; (7)伊紅染色，將切片放入伊紅染料中5 min進行染色，后取出放入無水乙醇中將伊紅染料洗凈; (8)透明，將切片放入二甲苯(I)溶液5 min后取出放入二甲苯(II)溶液5 min; (9)封片，用中性樹脂封固切片，過程中避免產(chǎn)生氣泡; (10)圖像采集，DP73型數(shù)碼顯微鏡下觀察前額葉皮質(zhì)層細胞損傷情況，拍照并記錄。

2.4.2 TUNEL染色： (1)將腦組織從多聚甲醛溶液中取出，石蠟包埋后切成厚度為4 μm的常規(guī)切片; (2)將切片依次放入二甲苯(I)溶液內(nèi)浸泡10 min,取出后放入二甲苯(II)溶液10 min脫掉石蠟;(3)將脫蠟后的切片依次放入無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各浸泡5 min，洗凈二甲苯溶液，再放入蒸餾水中; (4)蛋白酶K處理組織，37 ℃濕潤反應20 min; (5)PBS漂洗2次，每次5 min; (6)甩去PBS，擦干組織后，每個樣本加入50 μL的TDT酶工作液，37 ℃避光濕潤反應60 min。

3 結(jié)果

3.1 大鼠學習能力、沖動多動行為的比較 與空白對照組相比，模型組平均潛伏期時間明顯延長，差異有顯著性(P<0.05)；與模型組相比，甘麥大棗湯組和利他林組平均潛伏期縮短，差異有顯著性(P<0.05)。與空白對照組相比，模型組目標象限停留時間縮短，穿越平臺次數(shù)減少，平均速度加快，總路程延長，差異有顯著性(P<0.05)；與模型組相比，甘麥大棗湯組和利他林組目標象限停留時間延長，穿越平臺次數(shù)增多，平均速度減慢，總路程縮短，差異有顯著性(P<0.05)。詳見表1。

表1各組大鼠Morris水迷宮試驗的比較

3.2 大鼠前額葉皮質(zhì)層病理形態(tài)觀察的比較

3.2.1 大鼠前額葉皮質(zhì)層HE染色結(jié)果： 由圖1可見，鏡下觀察空白對照組前額葉皮質(zhì)層，可見錐體細胞排列緊密，層次分明，結(jié)構(gòu)有序，細胞形狀規(guī)則，細胞核清晰可見，呈現(xiàn)深染，神經(jīng)元細胞數(shù)量多，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整； 鏡下觀察模型組前額葉皮質(zhì)層，可見錐體細胞排列稀疏，層次不清，結(jié)構(gòu)混亂，細胞形狀不規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)大多不清晰，神經(jīng)元細胞數(shù)量較少，排列不齊，結(jié)構(gòu)不完整； 鏡下觀察甘麥大棗湯組前額葉皮質(zhì)層，可見錐體細胞排列較為緊密，層次比較分明，結(jié)構(gòu)有序，細胞形狀大多規(guī)則，細胞核多數(shù)清晰可見，呈現(xiàn)深染，神經(jīng)元細胞數(shù)量尚可，排列比較整齊，結(jié)構(gòu)較為完整； 鏡下觀察利他林組前額葉皮質(zhì)層，可見錐體細胞排列較為緊密，層次比較分明，結(jié)構(gòu)有序，細胞形狀大多規(guī)則，細胞核多數(shù)清晰可見，呈現(xiàn)深染，神經(jīng)元細胞數(shù)量尚可，排列比較整齊，結(jié)構(gòu)較為完整。

圖1 各組HE染色對照圖(×200)

3.2.2 大鼠前額葉皮質(zhì)層TUNEL染色結(jié)果： 由圖2可見， 鏡下觀察空白對照組前額葉皮質(zhì)層， 多見TUNEL陰性細胞， 表現(xiàn)為核著淺藍色， 細胞界限不清且疏散； 鏡下觀察模型組前額葉皮質(zhì)層， 可見大量TUNEL陽性細胞即凋亡細胞， 表現(xiàn)為細胞核固縮，胞體縮小，形狀不規(guī)則且濃染呈現(xiàn)深褐色； 鏡下觀察甘麥大棗湯組前額葉皮質(zhì)層， 多見TUNEL陰性細胞， 可見少量TUNEL陽性細胞； 鏡下觀察利他林組前額葉皮質(zhì)層， 多見TUNEL陰性細胞。可見少量TUNEL陽性細胞。TUNEL陽性細胞率由高到低依次為： 模型組 、甘麥大棗湯組與利他林組、 空白對照組。

圖2 各組TUNEL染色對照圖(×200)

4 討論

ADHD是一種兒童時期比較常見的精神障礙類疾病，主要癥狀表現(xiàn)為與年齡不相符的注意力不集中、沖動多動的等行為障礙。其發(fā)病機制尚未被完全闡明，目前較為公認的理論為多巴胺缺陷致病假說，治療以興奮中樞神經(jīng)類藥物利他林為主。但利他林作為苯丙胺類藥物，有明顯的成癮性及副作用，中醫(yī)中藥在此方面有明顯優(yōu)勢。ADHD在古代中醫(yī)并無對應疾病，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)，目前中醫(yī)一般從“臟躁”等入手，臟腑辨證以心肝火旺兼有脾虛為主。課題組根據(jù)《中醫(yī)兒科臨床診療指南·兒童多動癥》《金匱要略》及《素問·宣明五氣篇》，治療上選擇“補脾”為入手點，以“脾藏意”理論為支撐，方用甘麥大棗湯作為實驗藥物。甘草味甘性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，有補脾益氣，調(diào)和諸藥等功效； 小麥味甘，微寒，歸心經(jīng)，有養(yǎng)心除煩的功效； 大棗甘溫，歸脾、胃、心經(jīng)，有補中益氣，養(yǎng)血安神的效果。“心病者宜食麥”(《靈樞·五味》),本方遵循“肝苦急,急食甘以緩之”(《素問·臟器法時論》)的治法，用甘潤之劑調(diào)補脾胃，以滋諸臟氣陰，清心肝之火。網(wǎng)絡藥理學研究表明[12]，甘麥大棗湯中的山柰酚可以保護神經(jīng)，改善認知功能障礙。

“脾藏意”的理論來自《素問·宣明五氣篇》。王冰在對“脾藏意”的注釋為“記而不忘者”，又對“意之所存謂之志”作出“專注而不移者”的注解。表明此處的“意”有記憶、思維與注意等含義，若“意”不正常，則會出現(xiàn)注意力不集中、記憶下降、沖動等ADHD的核心癥狀?！捌⒉貭I，營舍意”則體現(xiàn)了“意”的正常全賴于脾運化水谷精微，化生營氣，以營養(yǎng)意的生理功能。因此，本課題組以此理論為支點，認為“意”的正常與否受脾的功能影響。 Morris水迷宮行為學實驗結(jié)果表明，甘麥大棗湯組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，穿越平臺次數(shù)增多，目標象限停留時間延長，平均速度與規(guī)定時間內(nèi)總路程都明顯下降，證實了甘麥大棗湯能有效改善SHR大鼠的學習能力與空間探索能力，對其核心的注意力不集中、沖動多動等癥狀有明顯緩解。

本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)層中的細胞凋亡的陽性率均有顯著提高。甘麥大棗湯組與利他林組相比，前額葉皮質(zhì)層的細胞凋亡無明顯差異，且較空白對照組同樣無明顯差異，與模型組相比細胞凋亡的陽性率明顯下降。進一步確認了ADHD的發(fā)病伴隨著前額葉皮質(zhì)層的損傷，甘麥大棗湯可以有效改善細胞的受損情況。

綜上本研究結(jié)果證明，甘麥大棗湯可以有效改善SHR大鼠關于ADHD的核心癥狀，減少前額葉皮質(zhì)層細胞損傷與細胞凋亡，證明本方對ADHD有一定的治療效果，進一步豐富和發(fā)展了“脾藏意”理論的內(nèi)涵，為ADHD的中醫(yī)治療提供新的思路。