河北中醫(yī)學(xué)院 河北省高校中藥配方顆粒應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心 河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心

張 闖 李葆林 陳世雨 高 樂 田 偉 牛麗穎(石家莊 050091)

提要 目的：研究以不同廠家蛇床子配方顆粒為研究對(duì)象，采用“一測(cè)多評(píng)”(QAMS)法，為蛇床子配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法：以蛇床子素為內(nèi)參物，分別建立蛇床子配方顆粒中傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的相對(duì)校正因子，并利用相對(duì)校正因子計(jì)算6種成分的含量。同時(shí)，采用QAMS和外標(biāo)法(ESM)對(duì)不同廠家共16批蛇床子配方顆粒中上述7種香豆素類成分進(jìn)行含量測(cè)定，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性、可行性和適用性。結(jié)果：本研究建立的QAMS法同時(shí)檢測(cè)不同廠家16批蛇床子配方顆粒中7種香豆素成分的含量與ESM法之間無(wú)顯著性差異，且相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好。結(jié)論：本研究建立的一測(cè)多評(píng)法可用于蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制。

蛇床子FructusCnidii為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.) Cuss的干燥成熟果實(shí)，味苦性溫、歸腎經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)、殺蟲止癢、燥濕祛風(fēng)的功效[1-2]。蛇床子所含主要化學(xué)成分為蛇床子素等香豆素類化合物[3-4]。中藥配方顆粒因其即沖即服、易于攜帶等特點(diǎn)，臨床上應(yīng)用越來(lái)越普遍，其質(zhì)量控制逐漸成為中藥研究熱點(diǎn)之一[5-6]。本研究基于一測(cè)多評(píng)(QAMS)法，以價(jià)格較低、穩(wěn)定易得的蛇床子素為內(nèi)參物，建立蛇床子素與傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的相對(duì)校正因子(f)，從而利用一種對(duì)照品(蛇床子素)計(jì)算出蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分含量[7-9]，并將此結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證QAMS法在蛇床子配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)中的準(zhǔn)確度及可行性，以期為蛇床子配方顆粒的多成分質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世科技有限公司)、Ultimate3000雙三元液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、SPD-M20A高效液相色譜儀(日本島津公司)、電子天平(ME204E/02型，瑞士梅特勒-托利多公司)、Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)、KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 實(shí)驗(yàn)所用各對(duì)照品：傘形花內(nèi)酯(批號(hào)：J0222AS)與佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)：J1026AS)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，花椒毒酚(批號(hào)：16090904)、花椒毒素(批號(hào)：151019)、異茴芹素(批號(hào)：16081803)、歐前胡素(批號(hào)：160511)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，蛇床子素(批號(hào)：110822-201308)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，可供含量測(cè)定用色譜級(jí)甲醇(Fisher公司)，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。蛇床子配方顆粒樣品購(gòu)自省級(jí)醫(yī)院，蛇床子配方顆粒樣品信息見表1。

表1不同廠家蛇床子配方顆粒樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度線，超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為233.94 mg/L,115.75 mg/L,90.11 mg/L,152.47 mg/L,70.88 mg/L,547.39 mg/L,171.36 mg/L的單一對(duì)照品溶液。分別精密量取等體積上述對(duì)照品溶液，置同一量瓶中，配置成含傘形花內(nèi)酯33.42 mg/L，花椒毒酚16.54 mg/L，花椒毒素12.87 mg/L，異茴芹素21.78 mg/L，佛手柑內(nèi)酯 10.13 mg/L，歐前胡素78.20 mg/L，蛇床子素24.48 mg/L的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液的制備：精密稱取蛇床子配方顆粒(S1)0.1 g，倒入100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇100 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。濾紙過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A) - 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min,5%～30%A；10～23 min,30%～40%A；23～35 min,40%～40%A；35～40 min,40%～50%A；25～38 min,90%～100%A； 38～45 min,100%A)；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，進(jìn)樣體積10 μL，混合對(duì)照品和供試品溶液HPLC圖，見圖1。

注：1.傘形花內(nèi)酯;2.花椒毒酚;3.花椒毒素;4.異茴芹素;5.佛手柑內(nèi)酯;6.歐前胡素;7.蛇床子素。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍考察：將“2.1.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液分別稀釋至標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的1、2、4、8、16倍，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各對(duì)照品的回歸方程，結(jié)果見表2。

表2蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 (μg/mL)

2.3.2 精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素色譜峰的峰面積RSD分別為1.94%、2.17%、1.97%、2.16%、2.20%、2.51%、2.50%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一蛇床子配方顆粒供試品溶液(S1)，分別溶液配好后0、2、4、6、8、12、24、48 h，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果1～7號(hào)峰的峰面積RSD分別為0.62%、1.20%、1.29%、1.57%、0.66%、0.78%、0.84%，表明蛇床子配方顆粒供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批蛇床子配方顆粒6份，按方法與結(jié)果 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蛇床子配方顆粒中傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素色譜峰的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算其RSD分別為0.33%、1.59%、0.93%、1.04%、0.59%、0.77%、0.67%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)同批蛇床子配方顆粒(S1)6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別加入與蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分近似相等含量的對(duì)照品溶液，按照 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，1～7號(hào)峰的加樣回收率分別為100.62%、101.19%、100.69%、100.41%、100.09%、100.27%、100.22%，RSD分別為1.31%、0.49%、1.02%、1.14%、1.10%、1.04%、0.50%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 相對(duì)校正因子(fs/i)的建立 本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)矯正法。根據(jù)公式fs/i=fs/fi=As×Ci/(Ai×Cs)計(jì)算QAMS的相對(duì)校正因子(fs/i)，式中fs/i為內(nèi)標(biāo)物s對(duì)待測(cè)組分i的校正因子，As為內(nèi)標(biāo)物s峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物s濃度，Ai為組分i峰面積，Ci為組分i濃度。以蛇床子素為內(nèi)參物(s)，根據(jù)公式分別計(jì)算蛇床子素對(duì)傘形花內(nèi)酯(A)、花椒毒酚(B)、花椒毒素(C)、異茴芹素(D)、佛手柑內(nèi)酯(E)和歐前胡素(F)的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表3。同時(shí)，本研究還對(duì)不同高效液相色譜儀、不同色譜柱、不同進(jìn)樣體積、不同色譜柱柱溫、不同流動(dòng)相體積流量、不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)fs/i的影響，結(jié)果表明這些因素對(duì)fs/i無(wú)影響。

表3 各組分的相對(duì)校正因子測(cè)定結(jié)果

2.5 待測(cè)成分的色譜峰定位 本部分通過(guò)計(jì)算在不同色譜儀和不同色譜柱中，蛇床子配方顆粒中各組分的色譜峰與蛇床子素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間(ts/i)，對(duì)供試品中7種香豆素組分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同儀器與色譜柱測(cè)得的ts/i的RSD分別為2.53%、1.81%、1.78%、1.50%、0.57%、0.62%，均小于3%，表明可以以ts/i對(duì)蛇床子配方顆粒中各組分的色譜峰定位。

表4不同儀器與色譜柱測(cè)得各成分相對(duì)保留時(shí)間

2.6 QAMS與外標(biāo)法(ESM)測(cè)定結(jié)果的比較 取16批不同廠家生產(chǎn)的蛇床子配方顆粒，按照相同飲片量計(jì)算給藥劑量，制成供試品溶液。分別采用QAMS和外標(biāo)法計(jì)算不同廠家16批蛇床子配方顆粒中1～7號(hào)峰的含量，每批3份，結(jié)果見表5。比較QAMS法與ESM測(cè)得的各組分含量，發(fā)現(xiàn)2種方法測(cè)得的蛇床子配方顆粒中7種組分含量基本一致，RSD小于3%，可認(rèn)為建立的QAMS法可以替代ESM用于蛇床子配方顆粒中7種香豆素成分的含量測(cè)定。

表5 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定16批蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分含量測(cè)定的結(jié)果 (mg/g)

3 討論

本研究考察了3種高效液相色譜儀和2種色譜柱對(duì)蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分分離的影 響，同時(shí)通過(guò)不同進(jìn)樣體積、不通色譜柱柱溫、不同流動(dòng)相流速、不同檢測(cè)波長(zhǎng)，以及相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的可靠性進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同儀器、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速下的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.0%，說(shuō)明該QAMS法的系統(tǒng)耐用性良好。

本實(shí)驗(yàn)收集了6個(gè)廠家生產(chǎn)的16批蛇床子配方顆粒，根據(jù)常規(guī)的外標(biāo)法和建立的一測(cè)多評(píng)的方法，分別對(duì)16批蛇床子配方顆粒進(jìn)行含量測(cè)定和準(zhǔn)確度分析，驗(yàn)證了QAMS法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種含量測(cè)定的結(jié)果基本一致，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本研究建立的QAMS法可用于蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制。從16批蛇床子配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，7種香豆素類成分中，花椒毒酚與蛇床子素含量最高，而傘形花內(nèi)酯和花椒毒素含量較低。

本研究建立的QAMS分析方法，在只有蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，能夠利用相對(duì)校正因子同時(shí)測(cè)得蛇床子配方顆粒中7種成分的含量，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，對(duì)蛇床子配方顆粒評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的完善具有重要意義，也將有利于QAMS法在中藥質(zhì)量控制中的推廣。