劉宇超 黃巧 尹時(shí)華

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530000)

前庭神經(jīng)鞘瘤（vestibular schwannoma,VS），亦稱聽神經(jīng)瘤，占顱內(nèi)良性腫瘤的8-10%，約占橋小腦角腫瘤的80-90%[1]。大多數(shù)VS是散發(fā)性和單側(cè)的，而雙側(cè)腫瘤通常與2型神經(jīng)纖維瘤?。∟F2）相關(guān)[2]。其中NF2基因編碼的腫瘤抑制蛋白merlin功能喪失是神經(jīng)鞘瘤發(fā)病的重要步驟。而且NF2的雙等位體突變也在部分散發(fā)性VS中被發(fā)現(xiàn)[3,4]。盡管這些腫瘤在組織學(xué)上是良性的，但它們會(huì)導(dǎo)致耳聾、耳鳴和面癱，如果發(fā)展到很大的規(guī)模，會(huì)導(dǎo)致腦干受壓甚至死亡[5]。目前，手術(shù)治療仍然是較大腫瘤的無可爭議的推薦治療方法，而中小型腫瘤的治療可以通過反復(fù)的MRI觀察、手術(shù)或放射治療。另外，靶向藥物治療被認(rèn)為是既控制腫瘤生長，又可避免手術(shù)可能造成的面神經(jīng)功能損傷等不良預(yù)后的治療手段[6]。然而與神經(jīng)纖維化2型相關(guān)VS已經(jīng)存在靶向血管內(nèi)皮生長因子的單抗型血管生成抑制劑不同，散發(fā)性VS至今沒有合適的藥物治療，這與散發(fā)性VS的生長速度和大小上表現(xiàn)出很大的變異性有關(guān)[7,8]。

幾十年的研究已經(jīng)在許多方面對(duì)VS的生長機(jī)制進(jìn)行了探討。例如神經(jīng)鞘瘤發(fā)生的“四次打擊-三個(gè)步驟”的遺傳機(jī)制，即首先發(fā)生一個(gè)生殖系基因SMARCB1突變,然后伴隨著包含第二個(gè)SMARCB1等位基因和一個(gè)NF2基因突變的22號(hào)染色體的一部分損失,最后剩余的野生型NF2基因也發(fā)生突變，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[9,10]。另外，MEK/JUK等基因參與的merlin蛋白磷酸化失活[11]、miR-21/miR-7等microRNA表達(dá)模式異常[12,13]等表觀遺傳的改變也被學(xué)者們證明與VS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。除此之外，近年的研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的浸潤與散發(fā)性VS生長和血管生成顯著相關(guān)[14,15]，提示在惡性腫瘤的生長和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用的浸潤免疫細(xì)胞[16,17]可能在散發(fā)性VS的生長機(jī)制中也充當(dāng)重要角色。然而之前的免疫細(xì)胞在VS中的研究存在著相對(duì)狹隘的思路及技術(shù)缺陷，所以本研究將基于生物信息學(xué)方法通過分析Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中散發(fā)性VS的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，通過鑒定差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs）以及利用科學(xué)的CIBERSORT方法[18]初步了解樣本中浸潤免疫細(xì)胞的情況，為散發(fā)性VS的分子機(jī)制研究和藥物靶點(diǎn)的篩選提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

從GEO數(shù)據(jù)庫下載散發(fā)性VS相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE141801、GSE108524和GSE39645，僅篩選出散發(fā)性VS及正常的神經(jīng)組織樣本用于后續(xù)分析。

1.2 差異表達(dá)基因的鑒定

首先對(duì)GSE141801芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后使用limma R包篩選DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為adj.Pvalue小于0.05及|log2FC|大于1，并繪制火山圖和熱圖。隨后用clusterProfiler包對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(Gene ontology,GO)功能注釋和京都百科全書基因與基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)途徑分析，其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)三個(gè)功能組。篩選標(biāo)準(zhǔn)為調(diào)整后的P值小于0.05。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤分析

為增加免疫細(xì)胞浸潤分析可用樣本的數(shù)量，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，將GSE141801、GSE108524和GSE39645進(jìn)行合并，使用limma R包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批次矯正，并用聚類分析判斷矯正效果。隨后應(yīng)用CIBERSORT得到每個(gè)樣本的22種免疫細(xì)胞的含量矩陣，篩選出P值小于0.05的樣本。隨后用pheatmap包繪制熱圖；用vioplot包繪制小提琴圖；用corrplot包繪制免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖；最后進(jìn)行主成分分析，并用ggplot包可視化。所有分析均在R軟件（版本3.6.3）上完成。

2 結(jié)果

2.1 樣本信息

經(jīng)過篩選，共得到46例腫瘤組織及19例正常神經(jīng)組織的樣本數(shù)據(jù)，其中GSE141801貢獻(xiàn)36例散發(fā)性VS組織和7例正常神經(jīng)組織，GSE108524貢獻(xiàn)10例散發(fā)性VS組織和4例正常神經(jīng)組織，GSE39645貢獻(xiàn)8例正常神經(jīng)組織。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選與鑒定

經(jīng)過計(jì)算，共找到DEGs 1828個(gè)，其中上調(diào)基因939個(gè)，下調(diào)基因889個(gè)，火山圖見圖1A，熱圖如圖1B所示，可以看出DEGs在散發(fā)性VS與正常組織間的表達(dá)具有顯著差異。

圖1 DEGs的火山圖和熱圖A為差異基因的火山圖，紅色代表上調(diào)的基因，藍(lán)色代表下調(diào)的基因。B為差異基因的熱圖，橫軸代表每個(gè)樣本，縱軸代表差異基因，紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)。Fig.1 The volcano plot and heat map of DEGs.A is the volcano plot of the DEGs.Red represents up-regulated genes and blue represents down-regulated genes.B is the heat map of DEGs,the horizontal axis represents each sample,the vertical axis represents the differentially expressed genes,the red represents the high expression,and the blue represents the low expression.

GO功能注釋結(jié)果顯示（圖2A）DEGs在BP中主要富集于細(xì)胞激活、T細(xì)胞活化、細(xì)胞粘附的正向調(diào)節(jié)、白血球細(xì)胞?細(xì)胞粘附以及白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增生與調(diào)控；在CC中主要富集于膠原蛋白?包含細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞連接和胞質(zhì)囊腔；在MF中主要富集于受體配體活動(dòng)、細(xì)胞粘附分子結(jié)合和細(xì)胞因子受體結(jié)合。KEGG通路分析結(jié)果顯示（圖2B）DEGs主要富集在細(xì)胞因子?細(xì)胞因子受體的相互作用、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和細(xì)胞粘附分子等通路。

圖2 DEGs的GO分析（A）和KEGG通路分析（B）。圓圈大小代表基因富集的數(shù)目，圓圈越大表示富集的基因越多；顏色代表富集的程度，顏色越紅，代表富集程度越高。Fig.2 GO functional annotation(A)and KEGG pathway analysis(B)of the obtained differential genes.The circle size represents the number of gene enrichment.The larger the circle is,the more genes are enriched.The color represents the degree of enrichment,and the redder the color,the higher the degree of enrichment.

2.3 免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果

經(jīng)過計(jì)算及篩選，最后得到7例腫瘤組織樣本和8例正常神經(jīng)組織樣本的免疫細(xì)胞含量矩陣。在隨后的分析中，熱圖（圖3）顯示M2型巨噬細(xì)胞及激活的肥大細(xì)胞在樣本中含量較高。小提琴圖（圖4）顯示與正常神經(jīng)組織相比，散發(fā)性VS中的M2型巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的比例顯著增多（P<0.05）；而CD8+T細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的比例顯著減少（P<0.05）。22種免疫細(xì)胞的相關(guān)性熱圖(圖5)顯示構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞（0.76），幼稚CD4+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞（0.83），活化的CD4+記憶性 T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞（0.81），中性粒細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞（-0.7），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞（-0.7），未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（-0.76）。最后二維主成分分析結(jié)果顯示22種免疫細(xì)胞的含量能很好的區(qū)分散發(fā)性VS和正常神經(jīng)組織（圖6）。

圖3 免疫細(xì)胞浸潤的熱圖。橫軸代表樣本，藍(lán)色部分為正常組織，紅色部分為腫瘤組織；縱軸代表22個(gè)免疫細(xì)胞。顏色代表免疫細(xì)胞的含量，顏色越紅表示該免疫細(xì)胞含量越多。Fig.3 Heat map of immune cell infiltration.The horizontal axis represents the sample;The vertical axis represents 22 immune cells.The color represents the amount of immune cells,and the redder the color,the more immune cells there are.

圖4 散發(fā)性vs及正常組織中免疫細(xì)胞占比小提琴圖。橫軸為22個(gè)免疫細(xì)胞，藍(lán)色代表正常神經(jīng)組織，紅色代表散發(fā)性前庭神經(jīng)鞘瘤組織，縱軸為細(xì)胞占比。Fig.4 The violin plot of the proportion of immune cells in sporadicⅤS and normal tissue.There are 22 immune cells on the horizontal axis,the blue column represents normal nerve tissue,and the red column represents sporadic vestibular schwannoma tissue.The vertical axis is the proportion of cells.

圖5 22種免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性熱圖。紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，顏色越深，相關(guān)性越強(qiáng)；橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均表示22種免疫細(xì)胞。Fig.5 Heat map of immune cell infiltration.Red means positive correlation,blue means negative correlation,the darker the color,the stronger the correlation;The X-axis and Y-axis represent 22 types of immune cells.

圖6 二維主成分分析聚類圖。。綠色圓點(diǎn)表示腫瘤樣本，紅色圓點(diǎn)表示正常樣本。Fig.6 Two-dimensional principal component analysis cluster diagram.Green dots represent tumor samples and red dots represent normal samples.

3 討論

由于散發(fā)性VS生長過程中復(fù)雜的變異性，讓其藥物開發(fā)充滿挑戰(zhàn)。雖然近年針對(duì)NF2基因和其編碼的merlin蛋白等靶標(biāo)的機(jī)制研究有一定進(jìn)展，但距離精確控制聽神經(jīng)瘤生長仍很遙遠(yuǎn)。在這項(xiàng)研究中，我們基于GEO數(shù)據(jù)庫的挖掘?qū)EGs進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)散發(fā)性VS在T細(xì)胞活化、白血球細(xì)胞?細(xì)胞粘附以及白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增生與調(diào)控等免疫細(xì)胞相關(guān)功能中顯著富集，KEGG分析也顯示DEGs在細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相關(guān)信號(hào)通路顯著富集。細(xì)胞因子往往通過炎癥反應(yīng)、自由基和信號(hào)通路直接或間接影響腫瘤細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的不同免疫階段、抗原處理和遞呈中表現(xiàn)出不同的作用[19]，而細(xì)胞因子又往往是免疫細(xì)胞的產(chǎn)物，因此免疫細(xì)胞具有成為散發(fā)性VS藥物治療靶點(diǎn)的潛力。

在惡性腫瘤中，腫瘤微環(huán)境中的各種免疫細(xì)胞的浸潤比例與臨床結(jié)果密切相關(guān)并影響腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)已在許多研究中被證實(shí)[17,20]，盡管VS是良性腫瘤，但近年多項(xiàng)研究證實(shí)了炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的狀態(tài)與散發(fā)性VS的生長及血管生成密切相關(guān)[14,15,21,22]。說明控制VS中的免疫細(xì)胞狀態(tài)及炎癥或許能成為治療VS的手段之一。然而這些研究多依賴于流式細(xì)胞儀和免疫組化對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的識(shí)別來檢測(cè)單個(gè)免疫細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致一定程度的細(xì)胞丟失和結(jié)果偏倚。而基于最先進(jìn)的去卷積算法的CIBERSORT軟件能更精確地解決不同浸潤免疫細(xì)胞亞群在樣本中的浸潤情況，在細(xì)胞異質(zhì)性研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)[23,24]。

于是我們利用CIBERSORT方法，比較了散發(fā)性VS與正常神經(jīng)組織間22個(gè)免疫細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)兩組間的免疫細(xì)胞具有顯著差異。其中M2型巨噬細(xì)胞是浸潤最多的免疫細(xì)胞。與M1型巨噬細(xì)胞通過分泌白介素12，白介素16和干擾素-γ等促炎細(xì)胞因子來激活炎癥反應(yīng)，參與宿主固有免疫，抑制腫瘤生長不同[25,26]，M2型巨噬細(xì)胞主要分泌白介素10和轉(zhuǎn)化生長因子-β等細(xì)胞因子來抑制炎癥，抑制T細(xì)胞增殖和分化，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤基質(zhì)的血管生成[27,28]。CD163是M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，Vries等人通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)所有VS樣本均顯示一定程度的CD163免疫陽性并且CD163在快速生長腫瘤中的表達(dá)明顯高于緩慢生長腫瘤，同時(shí)在高表達(dá)CD163的腫瘤中，微血管密度的程度顯著增高[15]。這些發(fā)現(xiàn)都說明M2型巨噬細(xì)胞浸潤可能是VS的進(jìn)行性生長的重要因素，可以成為潛在的藥物治療靶點(diǎn)。激活的肥大細(xì)胞是另一個(gè)顯著增加的免疫細(xì)胞，一般情況下腫瘤微環(huán)境中的肥大細(xì)胞具有抗腫瘤的特性。一旦激活和脫顆粒，它們會(huì)變得高度促炎，并積極招募先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，以協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)[29]，同時(shí)肥大細(xì)胞通過釋放血管內(nèi)皮生長因子等經(jīng)典促血管生成因子和糜蛋白酶等非經(jīng)典促血管生成因子，積極參與血管生成[30]，所以肥大細(xì)胞也可能成為散發(fā)性VS的有效治療靶點(diǎn)。除此之外，未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞在散發(fā)性VS中也顯著增多，其作為T細(xì)胞的一個(gè)亞群，可進(jìn)一步分化，并能輔助CD8+T細(xì)胞發(fā)生腫瘤排斥反應(yīng)，抑制對(duì)自身和外來抗原的有害免疫反應(yīng)，甚至阻斷CD8+T細(xì)胞的活化和殺傷NK細(xì)胞[31,32]，我們推測(cè)未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞可能也在散發(fā)性VS的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

另外值得注意的是，顯著減少的免疫細(xì)胞主要集中在CD8+T細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等T細(xì)胞亞型，而近期的研究表明T細(xì)胞衰竭與許多慢性疾病的預(yù)后不良有關(guān)[33]，提示T細(xì)胞的缺失參與了免疫系統(tǒng)逃避機(jī)制，結(jié)合我們的研究結(jié)果，提示T細(xì)胞衰竭或許也參與了散發(fā)性VS的腫瘤免疫逃避，從而促進(jìn)了腫瘤的生長。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)某些免疫細(xì)胞間具有顯著相關(guān)性，這可能為后續(xù)免疫細(xì)胞在VS的研究提供思路。更重要的是我們通過主成分分析證明免疫細(xì)胞的變化作為散發(fā)性VS的一個(gè)內(nèi)在特征可以表現(xiàn)出個(gè)體差異，具有重要的臨床意義。

總之，我們通過生物信息學(xué)的方法，對(duì)散發(fā)性VS的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集于免疫相關(guān)通路及生物學(xué)過程，同時(shí)我們首次揭示了散發(fā)性VS中22種免疫細(xì)胞的浸潤情況，發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫細(xì)胞可能參與了散發(fā)性VS的發(fā)生發(fā)展，這些發(fā)現(xiàn)為免疫細(xì)胞在散發(fā)性VS的分子機(jī)制研究提供了理論依據(jù)，也為靶向藥物的開發(fā)提供了新的視角。