蔣林惠，陳 彬，周易枚，楊 俊，周 楠，陳 煜

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226000)

我國大米中真菌毒素和農(nóng)藥殘留量的情況一直以來都受到多方面的關(guān)注，日常監(jiān)督檢驗(yàn)過程中這兩類污染物時(shí)有檢出[1-2]，因此監(jiān)測大米是否受到真菌毒素和農(nóng)藥殘留的污染，對于保證大米的質(zhì)量安全具有非常積極的意義。

真菌毒素目前的國標(biāo)檢測方法主要有：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、薄層色譜法等。農(nóng)藥殘留量的國標(biāo)檢測方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等[3]。目前，我國現(xiàn)行的真菌毒素及農(nóng)藥殘留量的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)僅單獨(dú)測定其中一類污染物，未有真菌毒素和農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的標(biāo)準(zhǔn)。為此，建立一種適用于大米等糧谷中多種真菌毒素和農(nóng)藥殘留量同時(shí)檢測的方法，對于在實(shí)際檢測中提高效率、節(jié)約成本十分重要。本文基于QuEChERS前處理技術(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料及目標(biāo)化合物進(jìn)行方法改進(jìn)，建立一種液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測定大米中4種真菌毒素和5種農(nóng)藥殘留量的高通量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大米：購自農(nóng)貿(mào)市場。

主要儀器：Thermo Vanquish-TSQ Altis型液質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技；Milli-QReference型超純水器，密理博上海公司；氮吹儀，biotage/瑞典；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技；研磨機(jī)，IKA。

主要試劑：甲醇(默克，色譜純)、乙腈(默克，色譜純)、甲酸(阿拉丁，色譜純)、乙酸銨(國藥，色譜純)，無水硫酸鎂(安譜，>98%)，氯化鈉(安譜，優(yōu)級純)，C18(安譜)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：吡蟲啉(BePure，1 000 μg/mL)、阿維菌素(BePure，1 000 μg/mL)、嘧菌酯(BePure，998.2 μg/mL)、戊唑醇(BePure，998.7 μg/mL)、肟菌酯(BePure，999.7 μg/mL)、黃曲霉毒素B1(First Standard，100 μg/mL)、13C17黃曲霉毒素B1(Romer，0.5 μg/mL)、T-2毒素(First Standard，100 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(安譜，50 μg/mL)、赭曲霉毒素A(First Standard，10 μg/mL)，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為溶液型。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

購入的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇∶乙腈(1∶1，v/v)稀釋并配制中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液1 μg/mL(其中玉米赤霉烯酮為10 μg/mL)，于4 ℃下避光保存。根據(jù)需要用基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1樣品前處理方法

樣品粉碎后過20目篩，準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品粉末5.00 g(精確到0.01 g)，置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，浸泡過夜(-18 ℃)；加入4 g無水MgSO4，1 g NaCl，渦旋2 min，10 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液，加入100 mg C18，渦旋2 min，-18 ℃冷凍2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，經(jīng)40 ℃氮吹濃縮近干，加入初始流動相1 mL復(fù)溶，渦旋1 min，上清液過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS測定。

1.3.2檢測條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱，Accucore Aq，150 mm×2.1 mm，2.6 μm；流動相，A為5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水，B為甲醇乙腈(甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)，梯度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積2 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫比例

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式，正離子模式；掃描模式，SRM多反應(yīng)監(jiān)測掃描；離子源電壓3 500 V；離子傳輸管溫度300 ℃；蒸發(fā)溫度400 ℃；鞘氣35(Arb)；輔助氣8(Arb)；反吹氣0(Arb)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

測定真菌毒素和農(nóng)藥殘留，流動相通常由水和有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈)等組成[4]，流動相的選擇關(guān)系到樣品的分離度和離子化效果，也會對化合物在質(zhì)譜檢測的信號響應(yīng)值產(chǎn)生影響[5]。

為提高藥物目標(biāo)化合物的電離度，得到更好的靈敏度[6]，試驗(yàn)對比了5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-甲醇乙腈溶液(其中甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)、5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-甲醇溶液、5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-乙腈溶液、甲醇-水、乙腈-水5套體系，流動相選擇梯度洗脫，調(diào)節(jié)有機(jī)相比例使液相條件最佳。結(jié)果表明，流動相中加入0.1%甲酸及5 mmol乙酸銨能有效促進(jìn)目標(biāo)物的電離，并且有利于改善目標(biāo)物的峰形。而甲醇-水、乙腈-水作為流動相時(shí)，赭曲霉毒素A的峰形展寬；而加入甲酸的流動相，9種污染物均能得到較好的峰形[2]。另外，乙腈甲醇(1∶1)的有機(jī)相使得真菌毒素的分離和峰形效果較好。另外，根據(jù)色譜柱的柱長、內(nèi)徑、填料粒徑，本實(shí)驗(yàn)選擇0.3 mL/min的流速。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)測定的9種物質(zhì)(包含黃曲霉毒素內(nèi)標(biāo))，根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，均采用ESI+模式進(jìn)行掃描。應(yīng)用儀器自帶的工作站TSQ自動優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，首先采用母離子掃描模式，根據(jù)質(zhì)荷比確定母離子設(shè)置合適的離子源電壓，離子傳輸管溫度，蒸發(fā)溫度，鞘氣、輔助氣、反吹氣的氣流量，確保每個(gè)物質(zhì)都能獲得較好的相應(yīng)。再進(jìn)行SRM優(yōu)化，優(yōu)化子離子、碰撞能量、透鏡電壓。定量離子、定性離子的選擇參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。最終建立10種物質(zhì)的多反應(yīng)檢測掃描(SRM)方法。本實(shí)驗(yàn)中涉及的化合物的SRM詳細(xì)信息見表2。

表2 9種真菌毒素和農(nóng)藥殘留質(zhì)譜條件

2.3 樣品提取與凈化

大米粉的含水量較低，提取溶液需加入一定比例的水相以提高目標(biāo)化合物的提取率[7]。乙腈對于農(nóng)藥和真菌毒素均有良好的溶解性[5]，故選其作為提取液的有機(jī)相。提取液加入適量的甲酸，能夠有效提取對酸度和極性較為敏感的真菌毒素和農(nóng)藥殘留物質(zhì)[8]。

本實(shí)驗(yàn)中考察提取液乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)、乙腈-水(84∶16，v/v)兩種提取溶液對9種藥物的回收率和提取效果，并通過基質(zhì)匹配的外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算(其中黃曲霉毒素B1選擇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算)。

本實(shí)驗(yàn)乙腈-水提取液進(jìn)行提取時(shí)，赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的回收率較低，乙腈-水-甲酸提取液進(jìn)行提取時(shí)，9種污染物的回收率能夠符合60%～120%的規(guī)定[9]。

鹽析劑的作用是促進(jìn)水相和有機(jī)相的分層，使得待測物進(jìn)入到有機(jī)相中，從而提高提取效率[10]。本實(shí)驗(yàn)中采用經(jīng)典的鹽析劑品種和配比：4 g無水MgSO4，1 g NaCl。而凈化過程是一個(gè)除去提取液中雜質(zhì)并保證目標(biāo)化合物回收率的一個(gè)過程。通?？紤]采用C18、PSA進(jìn)行待測溶液凈化。C18對長鏈脂類物質(zhì)、甾醇等非極性的干擾物有良好的吸附效果，而PSA因其特殊結(jié)構(gòu)易與酸性真菌毒素(如赭曲霉毒素A)分子上的羧基反應(yīng)，影響其回收率。故在該實(shí)驗(yàn)中選擇C18100 mg作為凈化試劑。

2.4 方法的線性范圍和定量限

本實(shí)驗(yàn)選擇空白基質(zhì)提取液匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，減小基質(zhì)效應(yīng)對于準(zhǔn)確度的影響。用大米基質(zhì)空白配制4種真菌毒素和5種農(nóng)藥殘留的混合標(biāo)液，質(zhì)量濃度依次為10、20、50、100、150、200 μg/L；其中玉米赤霉烯酮為100、200、500、1 000、1 500、2 000 μg/L。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為10～200 μg/L(ZEN：100～2 000 μg/L)，9種藥物的回歸曲線的決定系數(shù)(R2)在0.995～0.999以上，線性關(guān)系良好。開展大米空白樣品添加試驗(yàn)，以10倍信噪比時(shí)的添加濃度為方法定量限，結(jié)果如表3所示，9種藥物的定量限在5 μg/kg(AFT-B1可將定量限降低至0.1 μg/kg)，玉米赤霉烯酮50 μg/kg。

表3 9種真菌毒素及農(nóng)藥殘留的線性及方法定量限

2.5 精密度和回收率

稱取不含9種真菌毒素和農(nóng)藥殘留的大米樣品，添加混合標(biāo)樣，添加濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為10、50、100 μg/kg，每個(gè)水平做3次平行。結(jié)果顯示，9種藥物的平均回收率為62.8%～98.1%，精密度為2.3%～13.5%(表4)。

表4 9種真菌毒素及農(nóng)藥殘留回收率及精密度 %

3 結(jié)論

通過本文的實(shí)驗(yàn)研究，建立起基于QuEChERS-液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)的大米中4種真菌毒素和5種農(nóng)藥殘留的快速檢測方案。該方法高效、準(zhǔn)確、集約，適用于大米中吡蟲啉、阿維菌素、嘧菌酯、戊唑醇、肟菌酯、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等9種藥物的定性定量快速檢測，能夠?yàn)榇竺字兄饕婢舅睾娃r(nóng)藥殘留的快速高通量篩查提供一定的技術(shù)支持。