蘭 楠，呂志陽，周雨晴，韓延南，王明心，彭忠祿*，樊竑冶*

1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009

2.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423099

黑色素瘤是一種侵襲性強(qiáng)、致死率高的惡性皮膚癌。轉(zhuǎn)移是造成黑色素瘤致死率高的主要原因之一[1]。黑色素瘤對傳統(tǒng)治療手段易產(chǎn)生耐藥性且預(yù)后差，其發(fā)病率和死亡率逐年升高[2]。雖然近年來靶向治療和免疫療法取得了一些進(jìn)展，但其療效有限[3-4]，因此亟待開發(fā)新的藥物和方法治療黑色素瘤。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細(xì)胞生長和代謝的主要調(diào)節(jié)因子，可感知和整合多種營養(yǎng)和環(huán)境因素來平衡營養(yǎng)供應(yīng)并調(diào)控細(xì)胞生長。mTORC1蛋白復(fù)合物由mTOR和其他組分組成，具有促進(jìn)合成代謝的作用，而核糖體蛋白S6的磷酸化常被用來指示mTORC1的活性[5]。mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常見于多種癌癥，并與癌癥的耐藥性、轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后等密切相關(guān)，S6的過度磷酸化與惡性黑色素瘤顯著相關(guān)[6]。此外，mTORC1通過激活核糖體S6蛋白激酶（ribosome S6 protein kinase，P70S6K）誘導(dǎo)黑色素瘤發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[7]。盡管雷帕霉素已用于治療胰腺癌，但雷帕霉素、依維莫司和替西羅莫司（mTORC1抑制劑）等在臨床試驗(yàn)中缺乏對黑色素瘤的客觀反映[8]。

秦皮素是從中藥秦皮中提取出的一種天然香豆素類化合物，具有抗菌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和腫瘤抑制等多種藥理學(xué)活性，具有良好的藥物研究和臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。秦皮素對乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移具有明顯的抑制或促凋亡作用[10-12]，但其對黑色素瘤細(xì)胞的作用鮮有報(bào)道。本研究探討了秦皮素對人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，為秦皮素治療黑色素瘤的臨床應(yīng)用提供理論支持與參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

A375細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

秦皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)B20990）購自上海源葉生物公司；p70S6K特異性抑制劑PF-4708671（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)HY-15773）購自美國MedChemExpresss公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8121025）、胎牛血清（批號(hào)2232246）購自美國Gibco公司；Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)9168007）、Transwell小室（批號(hào)07920027）購自美國Corning公司；p-mTOR抗體（批號(hào)11221）購自美國Signalway Antibody公司；p70S6K抗體（批號(hào)2708）、p-p70S6K抗體（批號(hào)9234）、S6抗體（批號(hào)2217）、p-S6抗體（批號(hào)2211）購自美國CST公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）抗體（批號(hào)AB92536）購自英國Abcam公司；MMP9抗體（批號(hào)00673298）、vimentin抗體（批號(hào)6619511）購自美國Affinity Biosciences公司；N-cadherin抗體（批號(hào)00059228）、HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)SA00001-4）購自美國Proteintech Group公司；β-actin抗體（批號(hào)AB0035）購自上海Abways Technology公司。

1.3 儀器

311型氣套CO2培養(yǎng)箱、MSC Advantage 1.5生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-Protein Tetra垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）；5200 Multi化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A375細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、95%相對濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞增殖

取處于對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，以2.5×105/mL接種至96孔板中，200 μL/孔，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加入藥物，使秦皮素終濃度為25、50、100、200 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化后用血球計(jì)數(shù)板對每孔細(xì)胞密度進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)量。

2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取處于對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，以500/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后加入藥物，使秦皮素終濃度為40、60、80 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。每3天更換培養(yǎng)基和藥物，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆斑時(shí)（約14 d）停止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2次后加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min后流水清洗，待其自然風(fēng)干后，拍照記錄。

2.4 Western blotting實(shí)驗(yàn)

收集對照組及不同濃度秦皮素或PF-4708671（10 μmol/L）處理48 h后的A375細(xì)胞，加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸變性10 min。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液封閉1 h，分別加入對應(yīng)的抗體于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，再加入HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶10 000）于室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，采用凝膠成像儀顯影。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

A375細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長滿時(shí)，用滅菌的200 μL槍頭垂直于皿底劃線，每孔劃3道劃痕，PBS清洗3次，加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入藥物使秦皮素終濃度為40、60、80 μmol/L，PF-4708671終濃度為10 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于顯微鏡下拍照，使用Image J軟件分析0 h和48 h所拍照片的劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。

劃痕愈合率＝(0 h劃痕面積－48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積

2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠至230 μg/mL，吸取100 μL Matrigel基質(zhì)膠鋪入Transwell上室，于培養(yǎng)箱放置4 h。取處于對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/mL，加入藥物使秦皮素終濃度為80 μmol/L、PF-4708671終濃度為10 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。吸取100 μL上述無血清細(xì)胞懸液于Transwell上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h。Transwell小室經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后，用0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，用濕潤的棉簽擦除Transwell膜上層的細(xì)胞，自然風(fēng)干后，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraghPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)分析。

3 結(jié)果

3.1 秦皮素對A375細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

如圖1-A所示，不同濃度秦皮素（25、50、100、200 μmol/L）處理A375細(xì)胞48 h后，與對照組比較，秦皮素顯著抑制A375細(xì)胞的增殖（P＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。經(jīng)計(jì)算，秦皮素作用于A375細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為98.03 μmol/L，因此選用40、60、80 μmol/L的秦皮素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1-B，與對照組比較，秦皮素顯著抑制A375細(xì)胞克隆形成率（P＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。表明秦皮素能夠抑制A375細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。

圖1 秦皮素對A375細(xì)胞增殖 (A) 和克隆形成 (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of fraxetin on proliferation (A) and clonality (B) of A375 cells (±s, n = 3)

3.2 秦皮素對A375細(xì)胞p70S6K/S6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

mTORC1/p70S6K/S6信號(hào)通路影響細(xì)胞的存活、增殖，且該通路在黑色素瘤中異?；罨?。如圖2所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）處理A375細(xì)胞48 h后，對mTOR蛋白的磷酸化水平無影響，但顯著下調(diào)p70S6K及S6蛋白的磷酸化水平（P＜0.01），提示秦皮素可能通過抑制p70S6K/S6信號(hào)通路來抑制A375細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。

圖2 秦皮素對A375細(xì)胞p70S6K/S6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.2 Effect of fraxetin on p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.3 PF-4708671對秦皮素抑制A375細(xì)胞增殖和p70S6K/S6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為探究秦皮素是否通過p70S6K/S6信號(hào)通路影響A375細(xì)胞增殖，給予秦皮素（80 μmol/L）或p70S6K特異性抑制劑PF-4708671（10 μmol/L）處理細(xì)胞48 h，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見圖3-A，PF-4708671和秦皮素均可顯著抑制A375細(xì)胞增殖（P＜0.01）。如圖3-B所示，PF-4708671顯著上調(diào)p70S6K蛋白磷酸化水平（P＜0.01），同時(shí)下調(diào)S6蛋白磷酸化水平（P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。提示秦皮素可能通過下調(diào)p70S6K/S6抑制A375細(xì)胞增殖。

圖3 PF-4708671對秦皮素抑制A375細(xì)胞增殖 (A) 和p70S6K/S6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on proliferation (A) and p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions (B) in A375 cells (±s, n = 3)

3.4 秦皮素對A375細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

mTORC1/p70S6K/S6信號(hào)通路與EMT相關(guān)，如圖4所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）處理A375細(xì)胞48 h后，顯著下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin、vimentin）以及MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通過影響EMT相關(guān)蛋白表達(dá)抑制A375細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖4 秦皮素對A375細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.5 PF-4708671對秦皮素抑制A375細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組比較，秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理A375細(xì)胞48 h后，均顯著下調(diào)N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號(hào)通路影響A375細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。

圖5 PF-4708671對秦皮素抑制A375細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.6 秦皮素和PF-4708671對A375細(xì)胞遷移的影響

為探究秦皮素對A375細(xì)胞遷移能力的影響，同時(shí)避免秦皮素的細(xì)胞增殖抑制作用對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)基的血清濃度為1%。如圖6所示，經(jīng)秦皮素（40、60、80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理后，A375細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號(hào)通路抑制A375細(xì)胞遷移。

圖6 秦皮素和PF-4708671對A375細(xì)胞遷移的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of fraxetin and PF-4708671 on migration of A375 cells (±s, n = 3)

3.7 秦皮素和PF-4708671對A375細(xì)胞侵襲的影響

如圖7所示，與對照組相比，經(jīng)秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理后，A375細(xì)胞轉(zhuǎn)至Transwell下室的數(shù)量顯著降低（P＜0.01），且二者聯(lián)用時(shí)轉(zhuǎn)移至下室的細(xì)胞進(jìn)一步減少（P＜0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號(hào)通路抑制A375細(xì)胞的侵襲能力。

圖7 秦皮素和PF-4708671對A375細(xì)胞侵襲的影響 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of fraxetin and PF-4708671 on invasion of A375 cells (±s, n = 3)

4 討論

黑色素瘤細(xì)胞具有增殖速度快、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能強(qiáng)、早期易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素通過抑制p70S6K和S6的磷酸化水平，有效地抑制了人黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示秦皮素有治療黑色素瘤的潛質(zhì)。

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致黑色素瘤患者死亡的主要原因。黑色素瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移之前通常會(huì)經(jīng)歷EMT，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性逐漸消失，并出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞特征，而發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲[14]。N-cadherin和vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其蛋白表達(dá)水平的升高是細(xì)胞發(fā)生EMT的重要特征。N-cadherin是一種黏附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)黏附。N-cadherin表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)多種上皮癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力[15-17]。Vimentin是中間纖維蛋白最主要的組成成分，與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞骨架，參與調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞形狀變化和遷移速度。研究表明，在EMT過程中，vimentin表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞黏附性減弱、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)[18]。MMP2和MMP9可促進(jìn)基底膜以及胞外基質(zhì)中明膠和膠原蛋白降解，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力；在發(fā)生EMT的黑色素瘤細(xì)胞中，MMPs表達(dá)上調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素抑制了A375細(xì)胞中N-cadherin、vimentin、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，提示秦皮素可能通過抑制A375細(xì)胞的EMT來抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，從而阻止黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

p70S6K是屬于AGC激酶家族的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以被不同的生長因子或胰島素樣因子通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/mTOR通路磷酸化[20]。S6是核糖體40S亞基的重要蛋白質(zhì)組成成分，是p70S6K激酶下游的重要靶蛋白。p70S6K/S6信號(hào)通路對腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、細(xì)胞周期進(jìn)展等有重要作用。抑制p70S6K可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移[21]；敲除p70S6K會(huì)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及裸鼠中腫瘤形成[22]；敲除S6可以抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素以p-mTOR非依賴性的方式下調(diào)了p70S6K和S6的磷酸化水平。為研究秦皮素對A375細(xì)胞的作用是否依賴于p70S6K激酶活性，使用p70S6K的特異性抑制劑PF-4708671進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PF-4708671上調(diào)了p70S6K蛋白的磷酸化水平，下調(diào)了S6蛋白的磷酸化水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]；PF-4708671抑制了A375細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，與秦皮素效果類似，表明秦皮素可能通過p70S6K/S6信號(hào)通路抑制A375細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

p-mTOR上調(diào)表明mTORC1活性增加，mTORC1可以直接磷酸化下游蛋白p70S6K。本研究結(jié)果顯示，秦皮素上調(diào)p-mTOR蛋白表達(dá)，下調(diào)p-p70S6K和p-S6蛋白表達(dá)。由于蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）是mTOR的上游激酶，而p-S6能夠負(fù)反饋抑制Akt活性[24]，因此當(dāng)秦皮素下調(diào)p-S6表達(dá)后，其對Akt的負(fù)反饋抑制作用解除，導(dǎo)致mTOR被活化即p-mTOR上調(diào)。推測秦皮素可能通過與mTOCR1或其調(diào)控因子結(jié)合而抑制mTOCR1活性，從而影響其對p70S6K的磷酸化；秦皮素在抑制mTORC1活性的同時(shí)累積了mTOR在S2448位點(diǎn)的磷酸化。秦皮素對mTORC1/p70S6K/S6信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突